辐射诱导长期小鼠造血系统损伤模型

一、疾病概述

随着科学技术的进步，核电设施使用增多，人类太空活动能力提升使辐射暴露的可能性不断增加。另外临床接受放射性治疗癌症患者也在不断上升。造血系统和免疫系统对电离辐射（Ionizing Radiation，IR）具有高度的敏感性。受照后不仅会引起急性骨髓抑制，对远期造血免疫功能也会有影响。受到亚致死剂量照射后会出现造血免疫系统急性损伤性变化。随着时间延长机体各项免疫指标逐步恢复，但也会出现一些持久性改变，从而影响机体的健康状态。

二、模型背景

1、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

2、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。随着核电站的建立，人类太空活动的增加，临床上放射诊疗设备的广泛应用，以及核武器恐怖威胁等因素的存在，人类的辐射暴露性可能性日益增加。2001年美国国家辐射保护委员会指出，当出现核事故，多数人可能受到1．10Gy齐J量的电离辐射(Ionizingradiation，IR)照射。辐射引起的重要脏器损伤会导致受照射人员死亡。其中，骨髓抑制(bonemarrow suppression)是一个主要的致死原因。骨髓抑制分为急性骨髓抑制(acutebone marrow suppression)和长期骨髓抑制(10ng—termbone marrow suppression)，急性骨髓抑制主要是电离辐射引起的造血祖细胞(hernatopoieticprogenitor cells，HPCs)和少量的造血干细胞(hematopoieticstem cells，HSCs)凋亡，以及诱导造血祖细胞增殖障碍。临床上，可以给予造血细胞因子(hemopoieticfactors，HGF)缓解症状。长期骨髓抑制是辐射远期损伤的主要表现，也是临床进行肿瘤放疗、化疗时最常见的毒副作用之一，直接影响到治疗效果及患者的生存质量。长期骨髓抑制不像急性期骨髓抑制，往往患者外周血象并无明显异常，尤其给予细胞因子治疗后，外周血白细胞有了较好的恢复；长期骨髓抑制具有迟发性，在临床上容易被忽视，目前尚无有效治疗手段。

从细胞层面，电离辐射可以诱导造血干细胞、祖细胞细胞的凋亡，损伤造血千细胞、祖细胞的增殖能力，诱导造血干细胞进入细胞周期，无法维持在静止期，并且会损伤造血干细胞微环境的功能。

从分子层面，辐射诱导的DNA损伤，氧化应激和端粒缩短均是造血干细胞衰老的诱因。其中IR诱导的氧化应激或活性氧水平升高具有重要作用。电离辐射诱发细胞内活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的表达。ROS主要包括超氧阴离子(02-)，羟自由基(HO-)，过氧化氢(H2O2)，单线态氧(1O2)，次氯酸(HOCI)等组成。ROS正常条件下可以调节多种生理活动，病理条件下，产生过量的ROS则会引起DNA损伤，基因组不稳定性增加，随着年龄的增加，ROS损伤产物的累积会引起细胞衰老以及衰老相关的疾病。细胞ROS主要由线粒体呼吸产生，近来研究结果显示，由于造血干细胞大多数处于静止期，线粒体含量与骨髓中其他细胞相比线粒体含量非常低，在造血干细胞中，主要是由NADPH氧化酶家族中(NADPHoxidases，NOXs)的NOX4产生的ROS来调控造血干细胞的功能。HSCs比分化的细胞对氧化应激更敏感。

但是现有研究阶段缺乏辐射引起长期的造血系统损伤数据。对长期造血系统损伤缺乏深入研究。有待进一步研究长期造血系统损伤对整个机体及造血系统微环境的影响。

参考文献

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（一）实验材料

1.实验动物

10~12周龄的SPF级雄性健康C57BL/6J小鼠，体重22~24g，共24只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]。小鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物房屏障环境[SYXK(津)2014－0002]。本实验经过中国医学科学院放射医学研究所IACUC的批准，批准号为1402。并根据3R原则对实验动物的使用和饲养给予人道关怀。

2.试剂与仪器

荧光标记抗体NK1.1-FITC购于Biolegend公司；CD11b-APC，购于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7购于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC购于biolegend公司。EDTA-K3购于sigma公司。红细胞裂解液购于Invitrogen公司。大鼠脾脏单个核细胞分离液试剂盒购于索莱宝公司。EasySep™Mouse T Cell Isolation Kit购于STEMCELL Technologies公司。全自动血液分析仪MEK-7222K（日本光电）；BD流式分析仪（BDFACSAria II cell sorter，BD Bioscience ）。铯源伽马射线辐照仪（Gammacell-40，加拿大原子能有限公司）。

（二）实验方法

1.小鼠分组和照射

小鼠均分为三组：对照组（假照射组），4Gy IR组（4Gy组），6Gy IR组（6Gy组）,照射剂量率为1Gy/min。小鼠于SPF级动物房中饲养，照射后每天观察记录体重变化。

2 小鼠外周血常规检测

小鼠TBI后6m小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。

3 小鼠胸腺、脾脏指数测定

小鼠TBI 后6m称重安乐死，取胸腺、脾脏并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。

4 外周血免疫细胞和脾脏淋巴细胞分型检测

小鼠TBI后6m，将分离的小鼠脾脏研磨制备脾细胞悬液。分别取外周血和细胞悬液50μL，各加入1mL 1×红细胞裂解液，室温条件下裂解8min（期间混匀两次），1500r/min离心5min，4℃。弃上清，保持每个样本100μL体系，加入对应的混合抗体，冰上避光孵育30min。2mL PBS洗一遍，离心条件不变。加入300μLPBS过滤到流式管中，上机检测。

5 脾脏T细胞分离及P16mRNA表达量检测

小鼠TBI后6 m，按索莱宝ficoll试剂盒和STEMCELLTechnologies的T细胞阴选试剂盒说明书方法进行分离。将收集的细胞重悬计数，按每1~5×106个细胞加入1mL trizol保存，送至上海欧易生物医学科技有限公司检测P16mRNA表达量。

6 统计学方法

采用GraphPadPrism 6软件(SanDiego，CA，USA)处理数据、作图，计量资料数据用均数±标准差（x̅± s）表示，组间差异采用ANOVA检验和卡方检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

1. 受照小鼠受照后外周血计数检测

C57小鼠接受4Gy和6GyTBI，6m后全自动血液分析仪测定外周血，发现白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）、淋巴细胞百分比（LY%）下降，与假照射组小鼠有明显差异。中性粒细胞百分比（NE%）（图1）。

注：A.白细胞计数B.红细胞计数C.血红蛋白浓度D.血小板计数E.中性粒细胞百分比F.淋巴细胞百分比。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

图1. 受照组小鼠与对照组小鼠外血计数比较

2.免疫脏器系数

与对照组小鼠相比，4Gy组和6Gy组小鼠胸腺系数降低，。其中6Gy组与对照组差异有显著性（P＜0.05），脾脏系数略有增加，差异无显著性，结果见图2。

注：A.胸腺系数B.脾脏系数。*：P＜0.05。

图2. 受照组小鼠与对照组小鼠脏器系数比较

3.外周血免疫分型

相对于对照组，4Gy组和6Gy组CD4+均有上升，从分别从12.49±1.16%上升到14.6±0.51%和16.48±2%，均具有显著性差异（P＜0.05）。CD8a+细胞三个组别之间未见明显变化。CD4/CD8比值分别为对照组：1.16±0.10，4Gy照射组1.28±0.17，6Gy照射组1.46±0.26，6Gy组CD4/CD8比值与对照组比较有明显上升（P＜0.05）。B220+细胞从对照组62.89±2.33%降低到4Gy照射组55.63±3.61%和6Gy照射组54.2±3.54%，差异均具有极显著性（P＜0.001）。NK1.1+细胞与B220+细胞变化趋势一样，分别从8.44±0.7%降低到6.81±1.58%和6.6±0.65%。上述三组4Gy和6Gy之间差异均无显著性区别。单核细胞三个组别之间未见到明显差异。结果见图3。

注：A. CD4+ B. CD8+ C. B220+ D. NK1.1+ E. CD11b&F4/80+F. CD4+/CD8+。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

图3. 老年小鼠与年轻小鼠外周血免疫细胞分型比较

4.脾脏免疫细胞分型

相较于对照组，照射组CD3+细胞有上升的趋势，但无显著性差异。B220细胞，照射组均有明显下降，4Gy组和6Gy组相较于对照组有极显著差异（P＜0.01），两组之间未见明显差异。见图4。

注：A. CD3+ B. B220+。**：P＜0.01。

图4.受照组小鼠与对照组小鼠脾脏免疫细胞分型比较

5.脾脏T细胞P16mRNA表达量检测

结果显示，与对照组相比，6Gy组有个别数据p16 mRNA明显升高，采用卡方检验，未见显著性差异。结果见图5。

图5.受照组小鼠与对照组小鼠脾脏T细胞的P16 mRNA表达比较

在诱导模型过程中，照射设备具有自身屏蔽装置，使用安全，不会对人体及环境造成任何影响。

该模型在研究辐射损伤及机体老龄化相关的损伤中具有广泛的应用价值。国内已有相关单位咨询引用。