骨髓增生异常综合征急性转化转基因斑马鱼模型

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高危患者会转为急性髓系白血病(AML)，往往也会容易发展为难治性AML。与原发性急性髓系白血病不同，MDS/AML患者对化疗药物非常容易产生耐药性，并且是多药耐药，故本病对常规化疗不敏感，不容易取得完全缓解，需加大化疗剂量，从而造成了治疗难度。传统的治疗方法（化疗和骨髓移植）对于MDS/AML患者效果不佳，使得在传统治疗外又增加了分子靶向治疗。但目前MDS初始突变和积累突变的内在联系尚不清楚，MDS患者的病程进展机制仍然未知，这也就限制了针对MDS/AML的靶向药物研究，使已有的MDS/AML机制研究及药物治疗模式尚存不足。斑马鱼由于其独特的优势，例如与人造血发育过程类似，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选，在脊椎动物造血发育机制的研究中起着重要的作用。因此，获得MDS/AML斑马鱼白血病模型具备独特的优势：（1）阐明 MDS/AML过程中关键基因的改变，阐明这些基因之间的关系。（2）建立类似于人类白血病的斑马鱼疾病模型。藉此建立一个MDS/AML的白血病高通量靶向药物筛选平台。

通过North et al的文章描述的c-myb–gfp转基因斑马鱼与cmybhkz3/hkz3（cmyb基因缺失突变体）斑马鱼杂交后发现 cmybhkz3/hkz3 斑马鱼的造血缺陷表现被拯救。而后通过测序结果，我们发现c-myb–gfp转基因斑马鱼PAC中的有一段c-myb的部分重复序列。并且通过预测发现c-myb小核心启动子区域可以启动下游c-myb基因的表达。RACE实验证实Tg(c-myb-gfp)转基因斑马鱼产生除了原有的c-mybhkz3 转录本，另外发现了由c-myb-gfp中PAC产生的2种转录本（分别命名为c-myb-WT, c-myb-T1），至此， 我们将c-myb-gfp斑马鱼称为c-myb异常表达鱼系：c-mybhyper。并且通过western blot 实验，c-myb-T1转录本产生的蛋白可以稳定存在，导致c-myb 异常激活。之后通过WISH染色，SB染色，瑞氏-吉姆萨染色、组织切片染色、组织观察、流式分析核细胞学分析还有临床化疗药物对早期c-mybhyper 斑马鱼胚胎的给药实验，最后发现斑马鱼中c-myb 异常激活可以引起 MDS,AML 以及ALL，并且c-mybhyper斑马鱼模型的肿瘤表型可以被临床的化疗药物所缓解。

图 1. c-myb–gfp 转基因斑马鱼中 c-myb 基因表达量增多

c-myb–gfp转基因斑马鱼系首次在North et al的文章被描述，它是一种标记c-myb 阳性的HSCs转基因系。但是我们将c-myb-gfp与cmybhkz3/hkz3（cmyb基因缺失突变体）斑马鱼杂交以后，发现 cmybhkz3/hkz3 斑马鱼的造血缺陷表现被拯救了。通过对c-myb-gfp转基因斑马鱼cmyb基因的整胚原位杂交发现，c-myb基因表达在HSC产生的部位-主动脉性腺中肾区（AGM），尾部造血组织（CHT）以及肾脏中，并且相对于sibling，c-myb基因的表达增强了很多。

图 2. c-myb–gfp 转基因斑马鱼 PAC 中 c-myb 基因组结构

在之前的文章中，我们了解c-myb-gfp转基因斑马鱼系是用一段改造过的PAC 插入到野生型斑马鱼基因组中而被建立的。我们将c-myb–gfp转基因斑马鱼中PAC的GFP附近的区域及其下游进行测序，发现包括有c-myb小核心启动子区域以及一小片段的5’UTR，而且下游的c-myb基因并不完整，只到内含子10。而接着下游的序列分别是77bp的未知序列，氨苄青霉素抗性基因，pWSMK-T载体上的一段序列，c-myb小核心启动子区域完整的c-myb基因。测序结果提示我们下游中的从氨苄青霉素抗性基因到外显子10的序列可能是c-myb–gfp转基因斑马鱼PAC中的又一段重复序列。并且通过预测发现c-myb小核心启动子区域可以启动下游c-myb基因的表达。

图 3 5’and 3’-RACE PCR 产物

图 4 c-myb-WT 和 c-myb-T1 转录本和蛋白

为了研究c-myb-gfp转基因斑马鱼可以产生哪些c-myb基因的转录本，我们对c-myb-gfp/c-mybhkz3/hkz3 胚胎进行了RACE 实验。除了原有的c-mybhkz3 转录本，另外发现了由c-myb-gfp中PAC产生的2种转录本（分别命名为c-myb-WT, c-myb-T1）, 通过将 RACE 产物测序结果与野生型序列对比，发现其中由第二个小启动子启动的c-myb-WT转录本与野生型斑马鱼的c-myb基因转录本完全一致(如图 4 上)。4.3kb的c-myb-T1则由截断的c-myb外显子1到外显子10 以及一个接近完整c-myb 基因（外显子2到外显子15）组成(如图4 下)。至此， 我们将c-myb-gfp斑马鱼称为c-myb异常表达鱼系：c-mybhyper。

图 5 c-Myb-WT 和 c-Myb-T1 的蛋白

为了验证 PAC 产生的与内源性的c-myb 不同的转录本c-myb-T1，是否可以稳定的存在，我们使用了western blot 实验对c-myb-gfp 中c-Myb 蛋白进行抗体杂交，结果表明。 c-myb-gfp 中c-Myb-T1蛋白和c-Myb-WT一样可以稳定存在。

图 6 c-mybhyper 转基因斑马鱼髓系细胞标记物异常表达

图 7 c-mybhyper 转基因斑马鱼髓系细胞标记物异常表达

我们在c-mybhyper斑马鱼胚胎中利用谱系特异性标记物通过WISH 实验来观察c-myb 的异常增多对髓系细胞发育的影响。相对于对照组，我们发现巨噬细胞特异性标记物mfap4和c-fms的细胞在3dpf的c-mybhyper中都没有增多，而 cebpα标记的早期髓系细胞在c-mybhyper中数量明显增多。同样的，标记总体髓系细胞的lcp、表达成熟粒细胞特异性标记物lyz，mpx的细胞在3dpf的c-mybhyper中数量显著增多。这提示在c-mybhyper胚胎中积累的髓系细胞来源为粒细胞。在c-mybhyper 胚胎以及幼鱼中， 被 SB 染色所标记的粒细胞在CHT中显著增多。更重要的是，c-mybhyper 中SB阳性的粒细胞不仅数量增多，而且其大小更大、染色更深。以上的结果显示在c-mybhyper胚胎中积累的髓系细胞是粒细胞来源而不是巨噬细胞，并且这种粒细胞在早期发育时期存在功能和形态上的异常。

为了确认c-mybhyper中髓系扩增的表型是由于c-myb-WT还是c-myb-T1引起的，或者是共同作用导致的，我们使用elf1a瞬时启动过表达了c-myb-WT和c-myb-T1，结果发现与对照组相比，无论瞬时过表达c-myb-WT还是c-myb-T1都可以引起髓系增多，但是c-myb-T1中髓系增多的表型更为严重。由此我们推测，c-myb-WT和c-myb-T1可以共同导致髓系扩增。

图 9 c-mybhyper斑马鱼出现 MDS-like 表型

利用流式细胞仪以及细胞学实验分离c-mybhyper和同胞对照组中的血细胞。在 1 年的c-mybhyper中，PB血的组成比例与同胞对照组没有明显区别。然而与同胞对照组相比，KM中髓系细胞数量与同胞对照组相比增加了一倍，并伴随其它谱系细胞的减少，这些表型与髓系异常增生相符合。另外我们将c-mybhyper和同胞对照组的内脏在显微镜下解剖出来，我们发现与同胞对照组相比，1年的c-mybhyper斑马鱼肾脏面积更大，重量更重，这些内脏的缺陷以及浸润同样出现在人粒细胞性血液恶性肿瘤中。综上所述，c-mybhyper斑马鱼中血液表型和组织浸润与人的 MDS 症状类似。

表1 10-24个月c-mybhyper斑马鱼的血液分型

通过流式分析和细胞学分析10-24个月的成鱼，发现324条同胞鱼不会出现任何的疾病，而852条c-mybhyper斑马鱼则出现了18条AML和18条ALL，c-mybhyperAML-likePB中出现髓系祖细胞比例增多，有些KM中出现髓系祖细胞比例增多，与AML表型类似。并且部分AML-like 鱼出现了恶液质，眼肿，腹部肿块，出血。根据组织切片染色的结果，相对于MDS 样的c-mybhyper斑马鱼和对照组相比 ，AML 样c-mybhyper斑马鱼中具有髓系祖细胞形态的细胞浸润到多个组织中，KM 中累积的以及组织中浸润的粒细胞形态和粒细胞特异性染色以及胚胎时期的增多的粒细胞都提示AML中的白血病细胞类型为粒细胞，由此，c-mybhyper斑马鱼可以从MDS进展为粒细胞性的AML。

c-mybhyperALL-like斑马鱼出现淋巴细胞增多，与人ALL血象类似。并且部分AML-like 鱼出现了恶液质，眼肿，骨弯曲，出血。组织学分析显示在ALL样c-mybhyper斑马鱼中，淋巴细胞浸润到鳃，肌肉，肾脏，肝脏，眼睛以及脑中。另外在有rag2-dsRed 转基因斑马鱼背景的c-mybhyper中发现有斑马鱼出现rag2阳性细胞从胸腺像扩散到全身表型，与 ALL病人的浸润现象类似。这些结果提示c-mybhyper斑马鱼可以从MDS进展为ALL。我们进一步通过检测ALL样c-mybhyper斑马鱼中外周血中T细胞以及B 细胞的特异性标记物来鉴定c-myb 异常激活引起的淋巴白血病的细胞类型。通过 qPCR 发现c-myb异常激活引起的淋巴白血病的细胞类型既有T细胞源性的也有B细胞源性的。

图12 c-mybhyper MDS-like 斑马鱼对化疗药物的反应

c-mybhyper胚胎以及同胞对照用阿糖胞苷给药后，根据SB阳性粒细胞计数可得，阿糖胞苷处理后SB阳性粒细胞数量与未经过药物处理组相比显著减少，c-myb异常激活诱导的髓系异常增殖表型可以被细胞周期特异性抗增殖药物阿糖胞苷缓解。同时，与未经药物处理的c-mybhyper相比，经过弗拉平度处理的c-mybhyper中c-myb的RNA表达水平显著降低，同样的quizartinib对c-myb表达水平也无任何影响。结果表明临床上的c-myb靶向药可以减少c-mybhyper斑马鱼中的髓系细胞异常扩增。

图 13 c-mybhyper MDS-like 成鱼斑马鱼对化疗药物的反应

我们分别使用阿糖胞苷以及弗拉平度或者PBS 对成年的同胞鱼以及c-mybhyper斑马鱼进行腹腔注射。结果发现在药物处理以后弗拉平度明显地缓解了c-mybhyper成年斑马鱼髓系扩增的MDS表型。然而阿糖胞苷却没有效果。我们猜测是我们使用的剂量不够大以及处理时间不够长。在接下来的研究中可以进一步改善阿糖胞苷处理的条件。

我们发现了c-myb-gfp 转基因斑马鱼的cmyb异常激活特性。 在此斑马鱼中， 由于部分启动子序列以及c-myb 基因发生了复制，使得在c-myb-gfp 转基因斑马鱼中除了内源性 c-myb 外，又额外产生了两种c-myb 转录本，即 c-myb-T1和 c-myb-WT。 并且 c-Myb-T1 可以稳定存在，导致c-myb 异常激活。

研究结果显示斑马鱼中c-myb 异常激活可以引起 MDS,AML 以及ALL，并且c-mybhyper斑马鱼模型的肿瘤表型可以被临床的化疗药物所缓解。 提示 c-myb 可以作为特定类型白血病的一个新的治疗靶点。c-mybhyper斑马鱼模型也为在体新药筛选提供一个有价值的平台。