AAV注射诱导恒河猴多系统萎缩模型

一、疾病名称

多系统萎缩（Multiple system atrophy，MSA）

二、MSA简介

临床症状主要特征为植物神经功能紊乱，震颤，运动缓慢，肌肉僵硬，体位不稳和共济失调等。

病理表现主要为大脑多个部位（包括基底神经节，橄榄下核和小脑）的神经细胞变性、脱失和胶质细胞增生，在少突胶质细胞和神经元的细胞核、胞浆中存在嗜银包涵体。病变最严重的部位主要位于锥体外系（壳核、尾状核、苍白球、黑质、丘脑底核）、脑干（蓝斑、下橄榄核、脑桥核、迷走神经背核、前庭核）、小脑皮质、脊髓（中间外侧核）和锥体系。MSA包括Shy-Drager综合征（Shy-Drager syndrome，SDS）、纹状体黑质变性（striatonigral degeneration，SND）和橄榄脑桥小脑萎缩（olivopontocerebellaratrophy，OPCA）三种类型

发病机制可能有两条途径：一是原发性少突胶质细胞病变假说，即先出现以α-突触核蛋白（α-synuclein）阳性包涵体为特征的少突胶质细胞变性，导致神经元髓鞘变性脱失，激活小胶质细胞，诱发氧化应激，进而导致神经元变性死亡；二是神经元自身出现α-synuclein异常聚集，造成神经元变性死亡。

三、α-synuclein与MSA

胶质细胞胞浆包涵体（glial cytoplasmicinclusion，GCI）是MSA最具特征的病理改变。GCI呈新月、火焰状或椭圆，由松散聚集的细丝组成，可包裹细胞器。GCI主要丝状成分是α-synuclein，α-synuclein的突变可能在疾病发生过程中产生作用。α-synuclein基因（SNCA）rs11931074、rs3857059和rs3822086位点多态性可增加MSA患病风险。

构建过表达α-synuclein的腺相关病毒AAV-MBP-SYN及Olig001-CBH-SYN，分别以AAV-MBP-GFP及Olig001-CBH-GFP作为其对照，通过脑立体定位注射的方法注射到恒河猴（4-5周岁，体重3.5-5.5公斤）纹状体内，从而建立多系统萎缩的恒河猴模型。每只动物注射100μl，滴度为5×1012gcp/ml。

1、注射过表达α-synuclein腺相关病毒的恒河猴行为学表现

Viewpoint视频监测系统检测动物运动量

在脑立体定位注射过表达α-synuclein的腺相关病毒手术后，通过Viewpoint视频系统对动物进行运动量检测，注射AAV-MBP-SYN的模型动物结果。

注射Olig001-CBH-SYN的模型动物结果。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。