H9N2滴鼻感染雪貂模型

流感病毒是严重威胁人类健康的一种病原体，它能导致流感疫情甚至世界大流行，流感在各个年龄阶段的人群中都可能爆发而引起急性发热性呼吸道疾病。流感病毒为单股负链RNA病毒，属于正黏液病毒科，呈球形或丝状，直径80-120nm。病毒外层为两种不同糖蛋白构成的辐射状突起，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。根据HA和NA抗原的不同，又可分为许多亚型，H可分为16个亚型，N有9个亚型(N1～N9)。在所有的流感亚型中，H9N2备受关注，H9N2分布区域广泛，偶尔还可以感染人。值得注意的是，H5N1、H7N9、及H10N8亚型禽流感的6个内部基因均来自H9N2亚型病毒。文献报道H9N2亚型不经过适应即可在小鼠体内进行有效复制。另外，有文献报道，H9N2病毒在获得2009年甲型H1N1病毒内部基因后即可在雪貂群体间通过气溶胶传播。

一般感染H9N2的潜伏期为2～4d，平均3d。临床多为急性起病，早期表现类似一般流感,主要为发热，体温大多持续在39℃以上，热程1～7d,一般为3～4d,可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛和周身不适，少数患者有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征等多种并发症。感染H9N2预后良好。

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，感染后出现典型症状。

分子生物学研究显示，这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸，而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。

相较于其他流感动物模型，雪貂的优势为 ：（1）雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。（2）人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂，这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。（3）雪貂的气管较长，这样就使其上、下呼吸道区室化，有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。（4）雪貂作为动物模型比啮齿类大，易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。（5）在小型动物中，雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。

通过血凝抑制实验（HI），对若干6～10月龄的成年去势雪貂进行筛选，选出对于目前流行的流感病毒血清抗体均为阴性者。

在感染之前，将雪貂饲养在生物安全3级实验室中（ABSL3）中并监测5到7天以测量其体温。将皮下可植入温度应答器（BioMedic Data Systems;http://www.bmds.com）置于每个雪貂中，用于记录雪貂每天的体温。

雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染107EID50A/Brambling/Beijing/16/2012（H9N2）病毒（Genbank：KC464595.1、KC464596.1、KC464597.1、KC464598.1、KC464599.1、KC464600.1、KC464601.1、KC464602.1)。每天记录雪貂的临床症状并监测体温。感染后1，3，5，7，9d采集感染组和被传播组雪貂的鼻拭子和咽试子，置于1mlPBS中，接种鸡胚，测定鼻拭子和咽拭子中的病毒滴度。感染后第14天收集感染组雪貂的血清，HI实验测定血清转化情况。

1. 雪貂滴鼻感染后临床表现

在接种H9N2病毒的所有雪貂中均未观察到打喷嚏，但有两只雪貂出现了嗜睡和厌食的症状，病症持续2~ 3d。雪貂在感染后9天出现轻微的体重减轻（表1、图1（左））。感染后体温出现短暂升高，最高温度出现在接种病毒后的2-4天，此时间段内鼻拭子和咽拭子中的病毒滴度也达到高峰（图1（右））。

2. 雪貂模型感染后病毒在上呼吸道中动态复制情况

感染后第一天感染雪貂上呼吸道开始排毒，一直持续到感染后第7天。

3. 雪貂模型感染后血清特异性抗体产生情况

在感染后的第14天，接种病毒的雪貂产生高滴度的抗H9抗体（3只雪貂分别为5120,5120和10240）。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

6.2感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。