H5N1气溶胶吸入感染雪貂模型

禽流感依据其对禽类的致病能力大小可以分为三个程度：高致病性、低致病性和无致病性。其中高致病性禽流感包括H5和H7 两个亚型。但并非所有的H5 和H7 都是强毒株。人高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒某些亚型的毒株引起的人急性呼吸道传染病。由H5N1亚型禽流感引起的症状较重，病死率高。1997年，香港一名3岁的男童因感染禽流感而死亡，在随后的几个月中，共有18个人感染禽流感病毒，其中6人死亡。之后相继有 H9N2、H7N7亚型禽流感感染人类和 H5N1 亚型再次感染人类的报道,禽流感与人禽流感的关系开始倍受关注。2003年12 月中旬开始至今,朝鲜、越南、泰国、韩国、日本和中国等10 余个亚洲国家先后暴发H5N1高致病性禽流感疫情, 并且再越南、泰国、柬埔寨以及印度尼西亚出现了人感染高致病性禽流感病毒病例。据最新资料报道，世界卫生组织已证实泰国、越南和柬埔寨以及印度尼西亚自2004年1月起截至到2005年8月20日共有112人感染，其中导致57人死亡。而H7N7感染引起的症状相对较轻仅以眼角结膜炎和轻微的呼吸道症状为主。追溯历史，有报道的第一次禽流感感染人的事件发生在上个世纪的70-80年代的几例以自限性结膜炎为临床特征的H7N7感染病患。最近的一次发生在2003年荷兰一家农场有近80名工人及家属被确诊为H7N7感染,他们以眼部感染和呼吸道症状为主,其中一名兽医死亡,他的家人未接触病禽但也被证实H7N7感染。这起事件具有有限的人传人的证据。

禽流感病毒感染患者临床表现及致病机制

H5N1禽流感病毒感染的潜伏期一般为2～4天，平均3天。发病前1天就开始排毒，排毒时间儿童比成人长，免疫抑制者排毒可长达一个多月。临床表现为急性起病，早期表现类似一般流感。主要为发热，体温大多持续在38℃以上，热程1～7天，一般为3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛和浑身不适。少数患者可有恶心、腹泻、稀水样便等症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少，肾功能衰竭，败血症、休克及Reye综合征等多种并发症。

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

病毒株为A/wildbird/Hong Kong/07035-1/2011和A/Vietnam/1194/2004禽流感病毒，经血凝抑制（HI）实验，筛选出6月龄以下对当下流行的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9亚型流感病毒相应血清抗体均为阴性的去势雪貂。为了使动物适应并降低应激反应，所有雪貂均在感染前一周进行体温芯片的皮下植入和实验室适应（使用扫描仪监测体温，BMDS, USA）。感染组通过肌肉注射盐酸塞拉嗪对雪貂进行麻醉，轻度麻醉后感染组每只雪貂经鼻接种病毒。传播实验是在笼子中进行的，该笼子旨在防止动物之间的直接接触，但允许已接种的雪貂与相邻的幼稚雪貂之间保持气流。两组三只雪貂经鼻内接种104TCID50病毒400uL；一组接种了A/wild bird/HongKong/07035-1/2011病毒，另一组接种了A/Vietnam/1194/2004病毒。在感染后第24小时，将每只接种过的动物和幼稚的雪貂分别饲养在传播笼中，以测试病毒的传播能力。观察所有动物的临床体征，每天称重作为疾病的指标。分别在感染后第1、3、5、7和9天或暴露后从已接种和未接种过的动物收集鼻拭子和咽拭子，并转移至1 ml PBS中。通过在MDCK细胞中的终点滴定确定病毒滴度。

1.雪貂临床表现

两组三只雪貂经鼻内接种104TCID50病毒：一组接种A/wildbird/HongKong/07035-1/2011病毒，另一组接种A/Vietnam /1194/2004病毒。观察动物的临床体征，并每天称重以。两种病毒均使雪貂出现打喷嚏、耸毛、嗜睡和食欲下降。一只接种了A/Vietnam/1194/2004病毒的雪貂在接种病毒4天后死亡； A/wild bird /Hong Kong/ 07035-1/2011病毒感染的雪貂无死亡情况。攻毒后9天内，接种A/wild bird/HongKong/07035-1/2011病毒的动物体重下降峰值为10.3％，而接种A/Vietnam/1194/2004病毒的动物体重下降峰值为27.8％（表1，图1）。

表1 A/wild bird/HongKong/07035-1/2011感染雪貂的临床症状和排毒情况

2. 雪貂排毒情况

对于这两种病毒，从上呼吸道排出的病毒始于感染后第1天，一直持续到感染后第7天。使用鼻拭子检测到的上呼吸道排毒水平，接种A/Vietnam/1194/2004病毒的动物拭子中病毒滴度明显高于接种A/wildbird/HongKong/07035-1/2011的动物毒（P<0.01）。

两种病毒都没有通过呼吸道飞沫从接种的雪貂传播到幼稚的雪貂。机载接触组的雪貂的鼻拭子或咽拭子中均未检测到病毒）

3. 传播组雪貂血清中H5N1抗体水平

根据HI分析，接触雪貂的恢复期血清（暴露后21天）对病毒特异性抗体阴性。

生物安全性

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

1 受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

2 感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

3 感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。