SHIV-KB9静脉途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

Reimann等人以SIVmac239病毒基因组和B亚型HIV-1病毒的env基因为主体构建的一株嵌合病毒，即SHIV-89.6，经动物体内传代及克隆得到SHIV-KB9。由于在中国流行的8种类型毒株中，B'亚型是我国目前主要流行的HIV-1亚型，占47.5%。我国HIV-1B'亚型毒株与B.TH.92.92TH014最为接近，中国HIV-1B'亚型标准株的核苷酸序列与国际常用HMA分型的TH14、IND868、MA959、TH22等序列比较，相应亚型的核苷酸同源性是：B亚型90.2%,88.3%，说明B亚型和B'亚型之间存在很高的亲缘性。因此，SHIV-KB9病毒建立的动物模型，对我国的艾滋病疫苗以及疫苗评价和应用意义重大，为我国的疫苗研制提供很好的研究和评价平台。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为充分模拟静脉注射吸毒人群的感染方式，通过静脉途径，病毒直接感染血液中的靶细胞，从而制备静脉途径艾滋病恒河猴感染模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SHIV-KB9中国恒河猴细胞适应株，RT-PCR测定病毒拷贝数为4.8×108copies/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：4只恒河猴编号分别为A0423、A0424、A0425和A0426。病毒原液依次用无血清1640培养液做10倍系列稀释。经后肢静脉感染，每只猴注射1mL稀释好的病毒液。A0423-A0426分别注射10-1-10-4病毒液1mL。持续测定8个月。

4、 SHIV-KB9静脉感染猴样品采集和指标测定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、35、42、49、56、70及84天采集猴静脉血6mL，3mL EDTA抗凝，用于病毒载量和CD4+/CD8+值测定。

5、 SHIV-KB9静脉感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIV-KB9静脉感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

1、 临床症状

感染SHIV-KB9病毒后，A0425在感染后第120天出现食欲不振、水样腹泻、掉毛和体重减轻，到感染后第130天发展至严重水样腹泻，至18周后，愈发虚弱，直至感染后149天濒临死亡，动物安乐处死，并按计划取材留样。其余感染猴未出现皮疹、体重下降、食欲不振、机会性感染等典型的艾滋病症状。

2、 SHIV-KB9静脉感染恒河猴外周血病毒载量结果

在血浆病毒载量方面，A423和A424在感染后第7天首次出现阳性，之后载量上升，A423于感染后第14天达到它的最高峰（9.62×107 copies/mL），之后缓慢下降，但在我们的观察期（161天）内，一直维持在103 copies水平之上。A424在感染后第10天达到一个高峰（5.333×105 copies/mL），之后在103-106之间波动，到感染后第56天达到它的另外一个高峰（6.082×106 copies/mL），后在我们的观察期内未检测到病毒载量。A0425病毒载量在28天为7.22×105copies/mL，35天达到高峰3.51×108 copies/mL，随后下降，至10w降到了104 copies/mL，之后出现反弹，达到4.11×106 copies/mL，并长期维持在这个水平上直至发病。A426动物在整个实验期间，未检测到血浆病毒载量阳性（图1）。

图1 SHIV-KB9静脉感染中国恒河猴外周血病毒载量结果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIV-KB9

1、 SHIV-KB9静脉感染恒河猴CD4+/CD8+比值结果

四只实验猴CD4+/CD8+比例结果显示，实验前，其比值均大于1。接种病毒后，A423-A425在感染后前5周有个下降－回升－再下降的过程，其中A423于感染后21天降至最低值0.15，之后缓慢回升，在161天之前都在0.5之下徘徊，之后进入波动期，在0.26-0.78之间波动，但总体趋势是上升的，并于感染后357天回升至1.08。A424在前五周有几个幅度较大的波动，并于感染后35天达到最低点0.48，之后缓慢回升，从第35天的0.48一直波动回升到第329天的1.67。A425的初始CD4+/CD8+比值是四只猴中最高的，它在感染后第35天CD4+/CD8+比值达到最低点0.0125，之后缓慢回升，但一直维持在0.2以下，直至安乐处死。 A426的CD4+/CD8+比值在前三个月一直未见异常变化，到感染后91天出现下降，之后回升，维持于1附近（图2）。

图2 SHIV-KB9静脉感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio ofT lymphocytes in Chinese-originalrhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

SHIV-KB9静脉感染恒河猴CD4+细胞绝对数结果

病毒感染前，A4023-A0426四只猴的CD4+ T细胞绝对数都在1000个/μL以上。SHIV-KB9感染后，四只猴在感染后前三周都有个上升－下降－再上升－再下降的过程，（图3）。A0423在感染后21天到达最低点每μL血液中244个CD4+细胞，之后缓慢上升，到感染后203天超过1000个/μL。A0424在感染后28天到达最低点每μL血液中418个CD4+细胞，之后波动上升，到感染7周之后超过1000个/μL。A0425对SHIV-KB9的反应最强烈，在感染后3天它的CD4+ T细胞绝对数从最初的1073个/μL，迅速升到4270个/μL，到第10天更是升至5254个/μL，之后迅速下降，到感染后35天降为16个/μL，并维持这个水平一直到安乐。A0426也是在感染后28天到达最低点每μL血液中465个CD4+细胞，之后波动上升，到感染11周之后超过1000个/μL。

图3 SHIV-KB9静脉感染中国恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数

Fig.3 The CD4+ T cell counts(per l blood) in Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。