慢性束缚应激诱导大鼠抑郁模型

抑郁症是一种常见的神经精神疾病，患者常表现出情绪低落、消极、悲观、内疚、注意力不集中、对事物失去兴趣、睡眠和饮食障碍等特点，严重者甚至会产生自杀的想法[1]。据世界卫生组织报道，目前约共有3.5亿名抑郁症患者[2]。束缚应激，是一种将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式，模拟人类社会中无法避免的拥挤、压力性空间等应激因素，是目前建立单纯心理应激所致情绪障碍等神经精神疾病应用最广泛的造模方法之一[3-5]。

文献中关于建立该模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束缚应激动物模型都采用常用的模式动物, 如大鼠和小鼠。多选用封闭群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[6-9]。雄性多见。目前，文献报道的造模时间大多在4 -8 h/day、连续14-48 d [10]。本研究在前期实验研究和文献调研的基础军队6-14 h进行探究，本文选用10和14h，28d天观察对雌雄大鼠抑郁行为的影响，确定该模型诱导的抑郁模型为现代人类长期处于慢性应激作用下诱发的抑郁症机理研究、防护和药物研究提供实验模型。

参考文献：

[1]JP Lépine，M Briley，Theincreasing burden of depression. Neuropsychiatr．Dis Treat. 2011: 3-7．

[2] MN Hill，K G Hellemans，P Verma，et al．Neurobiology of chronic mild stress: Parallels to major depression．Neuroscience Biobehavioral Reviews，2012, 36(9) : 2085- 2117．

[3]迟强，许鹏，卢山，等．慢性束缚应激动物模型生物学特性及相关机制研究进展[J]．临床军医杂志，2013，12:1299－1301．

[4]唐已婷，陈家旭．慢性束缚应激动物模型的研究进展[J]．北京中医药大学学报,2002, 01: 25-28．

[5] LiuL，Zhou X，Zhang Y，et al．The identification of metabolic disturbances in the prefrontal cortex ofthe chronic restraint stress rat model of depression. Behavioural brainresearch, 2016, 305: 148-156．

[6] Chunhung Chiu, Charngcherng Chyau , ChinchuChen, et al. Erinacine A-Enriched Hericium Erinaceus Mycelium ProducesAntidepressant-Like Effects through Modulating BDNF/PI3K/Akt /GSK-3β Signalingin Mice. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(341):1-12.

[7] McLaughlin KJ, Gomez JL, Baran SE, et al. Theeffects of chronic stress on hippocampal morphology and function: an evaluationof chronic restraint paradigms. Brain Res, 2007, 1161:56-64.

[8] Kecheng Zhou, Junbin Yin, Huanghui Wu, et al.Danggui-Shaoyao-San, a Traditional Chinese Medicine, Relieved Depression andCognitive Disorder Induced by Chronic Restraint Stress Involved in RegulatingDendritic Spines Remodeling[J]. 2017.

[9] Liming Dong, Yi Wang, Jingwei Lv. Memoryenhancement of fresh ginseng on deficits induced by chronic restraint stress inmice[J]. Nutritional Neuroscience, 2017.

[10] Tatyana Buynitsky, David I. Mostofsky.Restraint stress in biobehavioral research: Recent developments. Neuroscienceand Biobehavioral Reviews. 2009,33:1089-1098.

1 动物：清洁级Sprague-Dawley 大鼠，雌雄各半

2 材料：行为限制器、医用棉签

3 仪器：无

4 模型诱导方法：

慢性束缚组大鼠每天早上9:00开始束缚，束缚强度为6h和14h，连续束缚28天。束缚时将动物放进大鼠束缚器内（直径 6.0 cm，长 21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由转身。束缚器顶部及四周有数个孔洞，以保持束缚器内空气流通，以防动物窒息死亡。束缚期间，模型大鼠放在临近的隔壁房间，正常组与束缚大鼠隔开，去除束缚后再放回原来的动物笼中。

图1 行为限制器的大鼠束缚装置图

1 实验材料

（1）药品与试剂：

盐酸西酞普兰 (西安杨森制药有限公司，中国，批号为22730060)、大鼠皮质酮ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司，中国)

（2）仪器：

① 行为学检测：空场、糖水偏爱、新奇事物探索

②蛋白含量检测：全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 评价方法

（1）行为学评价:

①空场：

利用自主活动实验计算机图像实时监测分析处理系统进行实验，该系统由自主活动测试箱、摄像系统和图像采集分析系统三部分组成。自主活动测试箱由4个圆柱形桶构成，摄像头系统对测试动物进行实时检测，并将动物的运动信息传送给视频卡，并通过软件对动物的运动信息进行分析处理。将大鼠置于测试箱适应2-3min后再进行测试，测试时间为10 min，测试时保持周围环境的安静，点击开始后图像采集分析系统自动记录各项数据。

②糖水偏爱实验:

在造模前进行训练和糖水偏爱测试（基线），基线测试即在大鼠禁食禁水23小时后，测定第24小时内的糖水/纯水的消耗量，计算糖水偏爱指数（糖水偏爱指数=糖水消耗/总液体消耗×100%)。造模28天后，再进行一次糖水偏爱测试，观察束缚大鼠的糖水偏爱指数的变化差异。

③新奇事物实验：

于自主活动实验次日将大鼠放入自主活动测试箱中测试。测试前在测试箱中央放入一个蓝色的圆柱体新奇事物。实验时将大鼠面向测试箱壁放入，并记录10 min 内首次探索新奇事物的时间（即潜伏期，10 min内无探索行为，则潜伏期时间记为10 min）、探索次数以及探索时间。

（2）皮质酮含量的测定

大鼠断头取血后将血液静止24 h，室温下3000r /min 离心10 min，取上清， 于4℃下8000 r/min离心10 min，取上清置于－80℃冰箱保存。采用ELISA法检测皮质酮含量，按说明书操作，利用全自动酶标仪检测吸光度，吸光度的检 测波长为450 nm评价结果。

（3）行为学结果

① 慢性束缚应激对大鼠体重的影响

如表1 所示，从第15 天开始，14h /28 d CRS 组雌性和雄性大鼠的体重均显著下降(P＜0. 01) 。而10 h /28 d CRS 组雌雄性大鼠与对体重无显著性差异。

表1 慢性束缚应激对大鼠体重的影响( n = 10，Mean±SEM)

注：与对照组相比*p<0.05；** P<0.01.

②慢性束缚应激对大鼠糖水偏爱指数的影响

如表2 所示，第1天糖水基线测试表明CRS 组雌雄性大鼠各组间的糖水偏爱指数无差异。与糖水基线比较，14 h /28 d CRS雄性组糖水偏爱指数水平明显下降(P＜0. 01)。与对照组相比，14 h /28 d CRS 雄性组的糖水偏爱指数及差值极显著低于对照组(P＜0. 01)。与糖水基线比较，14 h /28 d CRS 雌性组糖水偏爱指数水平明显下降(P＜0. 05)。与对照组相比，14 h /28 d CRS 组的糖水偏爱指数差值极显著低于对照组(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 组雌雄大鼠与自身糖水基线及对照组相比，均没有显著性差异。

表2 慢性束缚对大鼠糖水偏爱指数的影响( n = 10，Mean±SEM)

注: 与对照组相比，* P＜0. 05，**P＜0. 01。与糖水基线比较，＆P＜0. 05，＆＆P＜0. 01。

③慢性束缚应激对大鼠自主活动的影响

如表3 所示，与对照组相比，14 h /28 d CRS 组雄性大鼠的运动路程、运动时间、中央运动时间均极显著减少(P＜0. 01)，静息时间显著增加( P＜0.05)。同样，与对照组相比，14 h /28 d CRS 组雌性大鼠CRS 组的运动路程、运动时间、中央运动时间以及外周运动时间均极显著减少(P＜0.01)，静息时间显著增加(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 雄性组大鼠除在中央区运动时间比对照组少(P＜ 0. 05)，其他指标无显著差异。10 h /28 d CRS 雌性组的模型和对照组相比各指标均无显著性差异。

表3 慢性束缚对大鼠自主活动的影响( n = 10，Mean±SEM)

④ 慢性束缚应激对大鼠新奇事物探索行为的影响

如表4 所示，14 h /28 d CRS 组的雌雄性大鼠与对照组相比，潜伏期显著升高(P＜0. 01)，探索次数、探索时间明显下降(P＜0. 01)。14 h/28 d CRS雌性组的探索时间明显比对应雄性组长(P＜0. 05)，而14 h /28 d 雌性对照组的探索时间明显比对应的雄性组短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS 雄性组大鼠的潜伏期显著增长(P＜0. 05) ，探索时间明显减短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS雌性组大鼠仅潜伏期显著增长(P＜0. 05) ，探索次数及探索时间和对照组相比则无明显变化。

表4 慢性束缚应激对大鼠在新奇事物实验中探索行为的影响( n = 10，Mean±SEM)

注：与对照组相比，*P＜0. 05，**P＜0. 01。与对应雄性组相比，#P＜0. 05，##P＜0. 01。

（4）血清皮质酮检测结果

如表5，相比于对照组，模型组的血清皮质酮含量(P＜0. 01)明显增高，阳性药西酞普兰组相较于模型组动物的皮质酮水平也明显下降(P＜0. 05)。

表 5 慢性限制活动对SD雄性大鼠皮血清皮质酮水平的影响 ( n = 15, Mean±SEM)

注：与对照组相比，**P＜0. 01；与空白组相比，#P＜0. 05

本实验采用健康成年SPF级大鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

慢性束缚应激作为一种非损伤性刺激，能有效地引起典型的非特异性应激反应，且与人类身心性疾病的致病过程有相似性，是目前应用最广泛的一种抑郁症动物模型。与获得性无助、不可预测性应激等慢性心理应激模型相比，是建立单纯心理应激所致情绪障碍等神经精神疾病更适宜的造模方法。

研究报道，慢性应激抑郁模型会导致动物体重下降，14 h /28 d CRS 组雌雄大鼠与相应对照组比较体重显著下降，而10 h /28 d CRS组大鼠无显著性差异。一般认为抑郁动物的活动度减少，在陌生的环境里会减少对中央区域的探索。14 h /28 d CRS 组雌雄大鼠运动路程和时间、中央区活动路程和时间等指标显著减少，表明其对新奇环境好感度降低，表现出抑郁症的特征。10 h /28 d CRS仅雄性组在中央区运动时间减少。

机体奖赏系统的阈值增加，快感缺失为抑郁症的一个主要的症状，糖水偏爱实验则是目前使用最为广泛的一个用于评价快感缺失的动物行为学测试方法，14 h/28 d CRS 组动物糖水偏爱指数显著降低表明其具有快感缺失的抑郁样行为，而10 h/28 d CRS组雌雄大鼠与自身糖水基线及对照组相比均无显著性差异。

新奇事物实验是研究动物自发探索行为的一种方法。动物在已熟悉的空场环境中面临新奇事物时，产生既对新事物好奇又对新事物恐怖的矛盾冲突，出现接近-回避的冲突行为。抑郁动物在新奇事物实验中的探索行为减少，14 h /28 d CRS 组的雌雄性大鼠与对照组相比探索次数、探索时间明显下降，潜伏期时长显著增多，表明动物对新奇环境的探究能力下降，其对事物失去兴趣。10 h /28 d CRS 组仅雄性大鼠的潜伏期明显延长，探索时间缩短。

有文献指出慢性应激刺激对诱导雌雄大鼠抑郁样行为敏感性不同。为证实此本实验对雌雄鼠进行对比，发现与对照组相比，14 h/28d CRS雌雄大鼠的糖水偏爱指数及差值极显著低于对照组。10 h /28 d CRS雄性组在中央区运动时间比对照组显著减少，而雌性组各指标均无显著性差异。10 h /28 d CRS组雄性大鼠的潜伏期显著延长，探索时间明显缩短，而对应的雌性组大鼠仅潜伏期显著延长。这提示雄鼠可能对CRS更为敏感，更易表现出抑郁样行为。

此外，本实验室亦报道了慢性束缚6h/28天致使雄性Wistar大鼠表现出抑郁行为。在10h/28天束缚应激雌雄大鼠表现出一定的性别差异，雌性鼠对应激的的耐受力更强，CRS更易致雄性大鼠产生抑郁样行为。而慢性束缚应激（14h/28天）能显著表现出稳定的抑郁样行为，性别差异对其无影响。故我们推荐慢性束缚应激6~14h/28天雄性大鼠均能表现出抑郁样行为，在10h/28天束缚应激SD雌雄大鼠均表现出一定的性别差异，雌性鼠对应激的的耐受力更强。而慢性束缚应激（14h/28天）SD雌雄均表现出稳定的抑郁样行为。由此得出连续28 d、每天束缚14 h建立的抑郁症动物模型是一种更稳定的抑郁模型。

应激作用下会使得机体皮质酮含量升高，高皮质酮也会诱发抑郁样行为。持续注射皮质酮会使得大鼠出现快感缺失、行为绝望等抑郁样表现。临床数据也显示大部分抑郁症患者的皮质酮水平明显升高。本研究中发现CRS 14h/28天升高了SD血清中的皮质酮含量，而采用阳性药西酞普兰与应激组相比显著降低了皮质酮水平，表明慢性束缚应激（14h/28天）可能通过升高血清皮质酮含量，提高HPA轴兴奋，产生抑郁样行为。

模型技术难点在于由于束缚器是树脂材料的圆柱形，顶端有数个通气的小孔，各组动物体重应控制在适宜范围之内，满足其在束缚器中身体不能翻转，只能保持头部活动保持正常呼吸。另外，在束缚早期由于动物挣扎剧烈，会出现动物窒息的情况，所以一开始需要我们24 h观察，及时排除动物窒息死亡的情形。

与其他应激模式不同：慢性束缚应激是将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式（非损伤性刺激），能有效地引起典型的非特异性应激反应，且与人类身心性疾病的致病过程有相似性，是目前应用最广泛的一种抑郁症动物模型。