流感病毒感染C反应蛋白基因敲除小鼠模型

一、疾病概述

多种急性病毒性传染病会出现明显的免疫病理性损伤表现，从而出快速进展性重症感染、多组织损伤等病症，如禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重症感染、SARS、重症手足口病等。其共同的表现是引起细胞因子风暴或者高炎症因子反应，并多伴有多器官损伤的表现。已有的证据已经显示，免疫损伤在这些病毒感染的致病机制中起重要作用，有研究提示对禽流感、SARS等病毒感染进行炎症因子的控制有助于病例的恢复。因此，免疫损伤应是防控中不可或缺的一部分，构建免疫损伤相关动物感染模型，对于相关传染病的病理评估及相关控制策略的制定有着重要的意义。

二、模型背景

1、C-反应蛋白（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

C-反应蛋白(CRP)是穿透素家族成员之一，是宿主经典急性期反应蛋白，其通过细胞因子被激活，进而启动补体反应系统、招募免疫细胞在组织中积聚促进炎性反应、促进组织细胞凋亡等生物学效用。CRP 是一个磁盘样五聚体分子，由五个相同的含有206 个氨基酸的单体组成，其是一个钙离子依赖性的免疫调节蛋白，每个CRP 单体上有两个Ca2+的结合位点。尽管CRP 的生物功能仍然存在争议和很多不明确的地方，但是它作为先天性免疫反应担任重要角色是确定的。五聚体 CRP（pCRP)主要存在于体液循环中，在一定的条件下可被分解为CRP 单体（mCRP)，而mCRP 被认为是组织细胞结合特性的效应分子，通过膜融合、吞噬或者与配体结合在细胞表面形成微颗粒传递炎症刺激信号，从而在炎症扩散和积聚中发挥作用。

2、实验动物背景信息

本研究采用C57BL/6J小鼠作为CRP基因敲除鼠和人CRP转基因小鼠的的构建，C57BL/6J是第一个被全基因组测序的小鼠品系，被广泛用于科研和药物发现领域，C57BL/6J也被广泛用作基因工程小鼠的背景品系。此外C57BL/6J对多种病毒敏感，可作为流感病毒、柯萨奇病毒等感染模型使用。

3、研究背景

C反应蛋白（C reaction protein, CRP）是一种重要的炎症反应先天免疫调节因子，目前的研究显示，CRP 具有激活补体系统、招募免疫细胞在组织中积聚促进炎性反应、促进组织细胞凋亡等生物学效用。在禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重症感染、重症手足口病等急性传染病病例中，CRP均显示明显提高，且与疾病的转归存在潜在关系。因此，针对CRP在急性传染病免疫损伤中的作用研究有着重要的意义。而CRP是一个具有高度保守性的急性期反应蛋白，小鼠的CRP和人CRP具有高度相似性，人CRP的能够结合小鼠的FcɣR激活补体反应。本研究拟构建人CRP转基因小鼠和CRP基因敲除小鼠，建立流感病毒、柯萨奇病毒等感染免疫损伤相关小鼠模型，形成感染免疫损伤评价体系，为急性传染病的防控策略的建立提高依据。

近年来的研究显示，CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠已经在心肌梗死、急性肝损伤、急性肾损伤等多种疾病研究得到应用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1-4。研究结果显示， CRP在自身免疫性损伤相关疾病中发挥重要作用，并可能作为靶向治疗的一个潜在分子。

1、CRP基因敲除小鼠构建

利用CRISPR/Cas介导的基因组工程技术建立CRP基因敲除小鼠（C57/6J），小鼠染色体库：第37000000号小鼠染色体：第1号染色体，鉴定出两个外显子，ATG起始密码子在外显子1，TGA终止密码子在外显子2。外显子1到外显子2被选为靶位点，然后将体外转录产生的Cas9 mRNA和gRNA注射到受精卵中进行基因敲除小鼠生产。通过PCR和DNA测序分析进行基因分型鉴定F0小鼠，并将其育成野生型小鼠，进行种系传代并鉴定，筛选F1代杂合子。F1代小鼠间进行交配后产生F2代小鼠，对F2小鼠进行PCR基因鉴定，筛选纯合子小鼠。纯合子小鼠间再进行交配传代并进行鉴定，连续传3代，并进行鉴定，得到稳定传代系CRP基因敲除小鼠。 分别将流感病毒、柯萨奇病毒通过滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同时设定野生小鼠对照，定期采样分析病毒对小鼠的感染性，同时评价病毒对小鼠的致病性，分析CRP基因敲除对病毒致病性的影响。

2、人CRP基因转基因小鼠的构建

利用CRISPR/Cas介导的基因组工程技术建立人CRP转基因小鼠（C57/6J），将含有人CRP cDNA的供体载体ROSA26的gRNA与cas9mRNA共同注射进入受精的老鼠卵中，产生靶向敲入的后代。F0建立动物经PCR鉴定然后进行序列分析，对野生型小鼠进行种系传代和F1代检测鉴定，筛选纯合子小鼠。纯合子小鼠间再进行交配传代并进行鉴定，连续传3代，并进行鉴定，得到稳定传代系CRP基因敲除小鼠。 分别将流感病毒、柯萨奇病毒通过滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同时设定野生小鼠对照，定期采样分析病毒对小鼠的感染性，同时评价病毒对小鼠的致病性，分析人CRP转基因对病毒致病性的影响。

1、CRP基因敲除小鼠鉴定

采集鼠尾组织提取DNA，分别通过PCR和测序的方法对构建的F1代和传代CRP基因敲除小鼠进行表型鉴定，结果显示，CRP敲除小鼠能够稳定传代。

图1 CRP基因敲除小鼠PCR鉴定结果:（A）F1代纯合子小鼠鉴定结果；（B）传代小鼠3代以上纯合子小鼠鉴定结果。

2、分别用甲型H1N1流感病毒2009大流行株、甲型H1N1小鼠适应株PR8、人H7N9禽流感病毒、人H5N1禽流感病毒株、柯萨奇B3病毒感染CRP基因敲除鼠和人CRP转基因小鼠, 结果显示，相对野生鼠，甲型H1N1流感病毒2009大流行株和H7N9禽流感病毒在CRP基因敲除鼠和人CRP转基因鼠中均表现更高的致病性和致死性，病毒在肺组织中有效复制，造成支气管肺炎病理表现。而柯萨奇病毒B3在CRP基因敲除鼠较野生鼠没有明显的体重损失，而在人CRP转基因小鼠，其体重损失与野生鼠相似，但心肌炎病理改变更为明显。人H5N1禽流感病毒和甲型H1N1小鼠适应株PR8感染模型正在进行中。

图2 病毒感染CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠体重和致死率变化。（A）甲型H1N1流感病毒2009大流行株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP转基因小鼠(CRP-KI)体重和致死率变化;(B)H7N9禽流感病毒疫苗小鼠适应株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP转基因小鼠(CRP-KI)体重和致死率变化;（B）柯萨奇病毒B3感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP转基因小鼠(CRP-KI)体重变化。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

该动物模型已在多种疾病中进行了应用，技术方法和指标体系相对成熟，在流感病毒、柯萨奇病毒等急性病毒感染评价中应用鲜有报道，我们的结果提示，该感染模型的研究对于CRP在急性病毒感染的致病机制评价以及以治疗为目的的潜在靶向分子干预研究中将发挥积极作用。