IAV、SARS-CoV-2共感染K18-hACE2小鼠模型

新型冠状病毒SARS-CoV-2导致2019年冠状病毒病（COVID-19），如今正在肆虐。截至2021年4月28日，已有超过1.48亿例确诊感染病例，312万人死亡（https://origin-coronavirus.jhu.edu/map.html）。目前COVID-19大流行浪潮的结束时间和最终严重程度仍不确定。与此同时，流感季节与目前的COVID-19大流行合并，可能会带来更多的挑战，对公共卫生构成更大的威胁。 关于季节性流感是否会影响COVID-19大流行的严重性，以及在即将到来的冬季是否有必要接种流感疫苗，有很多争论。有人推测，甲型流感病毒（IAV）感染可能因SARS-CoV-2继发感染而导致更严重的疾病，或者这两种病毒的共同感染会导致更严重的疾病。然而，目前还没有实验数据显示IAV和SARS-CoV-2之间的关系。 在一项新的研究中，来自中国武汉大学的研究人员提供了第一个实验证据，证明IAV在先感染强烈地促进了SARS-CoV-2病毒在细胞和动物中的进入和感染性。这些数据强调，在SARS-CoV-2大流行季节预防流感是非常重要的。

1试验材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供，新型冠状病毒的全基因组序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)获得，存放于中国微生物数据中心（登录号NMDC10013001，基因组登录号MDC60013002-01）。

1.2 试验动物

选择SPF 级6 周至 11月龄各段的ICR 与 C57 BL/ 6J，18-22 g，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001）

2试验操作规程

2.1 人 hACE2转基因小鼠的制备

表达人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 启动子驱动，经 RT-PCR 和 Western blot 验证 hACE2 基因在小鼠肺组织内的表达（图3）[4]。

2.2 病毒传代

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

2.3 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染体积：50 μl 只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

2.4 动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重。

（2）病毒载量：定时收集各组动物脏器，进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察 用新鲜的组织制备冰冻切片，将组织固定在冷冻剂上，肺脏组织（10um）切好后在 100% 丙酮内固定 15 分钟，之后用 HE染色，镜下观察。

（5）免疫荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在小鼠肺脏上的定位。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

（6）感染后第14天，分离血清，测定特异性IgG。

2.5 数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析，感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

通过IAV和SARS-CoV-2假病毒或活病毒的共同感染，这些作者观察到SARS-CoV-2在细胞培养物和小鼠中的感染性大大增强。这种增强与ACE2的表达水平增加有关，其中ACE2是SARS-CoV-2进入宿主细胞的一个主要受体。他们检测到在IAV感染后，A549细胞的ACE2 mRNA水平增加了2至3倍。然而，在IAV和SARS-CoV-2共同感染后，检测到ACE2 mRNA水平有更大的增加（28倍）。

在K18-hACE2小鼠中，这种共感染使得气道上皮细胞中位于人类K18启动子控制下的ACE2表达增加了6.5倍（低于A549细胞中处于天然人ACE2启动子控制下的ACE2表达的28倍增加）。K18-hACE2小鼠中ACE2的诱导倍数较低，可能是由于只在转录后和翻译水平上进行调节，因为IAV和SARS-CoV-2共同感染对hK18启动子没有影响（数据未显示）。尽管如此，他们的数据显示，当敲降ACE2时，IAV介导的SARS-CoV-2感染的增强作用被完全取消，这再次表明ACE2是SARS-CoV-2感染增强的一个主要原因

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所 ABSL 3 实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

目前没有确证 有效的阳性药物，本单位用细胞模型从市售成药中筛选有效药物，发现 PHD1（药品代号）可以在细胞水平抑制病毒复制，随后用小鼠模型进行了药效学评价。发现药物治疗感染小鼠后，临床症状得到改善，病毒复制被显著抑制，肺组织病理明显改善，证明该药物可治疗感染小鼠。