Galetin-7基因沉默小鼠模型

一、疾病概述

众所周知，哮喘等过敏性疾病都具有复杂的病因，是环境和遗传共同作用的结果。长期外来刺激影响下，诱导患者某些基因的表达发生改变，引发支气管上皮细胞异常损伤，然后出现细胞凋亡，最后导致气道慢性炎症和哮喘的发生[7-11]。这些外来刺激包括环境烟雾、大气污染物、吸入变应原（如屋尘螨）、化学刺激物、病毒等。在相同的外界刺激下，如即使是在空气严重污染的重工业城市，也是只有少部分人发展成为哮喘患者，这就说明个人的遗传基础，即内因（哮喘易感性）是哮喘发生的关键因素。目前认为哮喘是一种有明显家族聚集倾向的多基因遗传性疾病，即哮喘的发生有患者的遗传基础。哮喘患者亲属发病率高于群体平均发病率。通过对比家族群间的遗传差异可以筛选出哮喘易感候选基因，为哮喘的早期预防和治疗提供依据。

二、模型背景

1、造模因素信息

半乳糖凝集素（galectin) 是凝集素超级家族中的一个家族，广泛分布于各种活性有机体内。已克隆并命名的成员有15个，结构上都有1或2个糖识别域，对β半乳糖苷有特殊的亲和力。半乳糖凝集素家族在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。半乳糖凝集素-7是由Madsen及其同事在研究维持人正常表皮细胞表型的标记时发现的。Galectin-7其相对分子量大小为14kD。Galectin-7还叫抑癌基因p53诱导基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表达在上皮细胞，特别是在复层上皮细胞，与细胞P53依赖性的凋亡，增殖，调控和分化有关。Francoise等的关于紫外线辐射（UVB）对表皮角质形成细胞Galectin-7表达可能产生的影响的研究显示UVB照射角质形成细胞后，Galectin-7的 mRNA和蛋白表达量迅速增加。表明Galectin-7的过表达与晒伤或角质形成细胞凋亡相关。曹等的研究表明Galectin-7在维持表皮稳态过程中至关重要。Niiyama等的研究证明在皮肤屏障破坏后，如特应性皮炎（AD）、老年性干燥症，表皮的角质形成细胞中Galectin-7的表达增加。且随着AD患者皮肤损伤程度的减轻，同时观察到角质层胶带剥离标本中Galectin-7的值降低。因此他们把Galectin-7作为判断皮肤状况的生物标志物。综上所述，Galectin-7是维持上皮稳态的关键细胞因子，而且其高表达与上皮屏障受损直接相关。

2、实验动物背景信息

BALB/c Mouse

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

目前哮喘的相关基因研究众多。Jun Kanazawa等人对2组独立的日本人群进行了候选基因关联研究，发现钙粘蛋白相关家族成员3（CDHR3）编码区的SNP突变（rs6967330，Cys529 / Tyr）会增加呼吸道病毒感染的遗传易感性，促进哮喘的发生[1]。Toll样受体（Toll-likereceptor，TLR）是先天免疫系统的关键部分。 TLR基因的变异与自身免疫性疾病，如过敏和哮喘有关。Petri Koponen等人分析了平均年龄为6.4岁的因支气管炎住院的133名儿童的TLR基因在1rs5743618，TLR2rs5743708和TLR6rs5743810三个座位的单核苷酸多态性。他们研究首次证明了TLR1的rs5743618座位基因变异与幼童的细支气管炎、哮喘以及湿疹的发生有关 [2]。Yu Utsumi等人招募了182名日本哮喘患者，并对受试者进行rs20541座位基因型分析。他们的结果显示IL-13基因rs20541位点的3组不同基因型的患者之间气道高反应性、FEV1％的预测值以及FEF75％的预测值存在显著差异，由此推测 IL-13基因中的rs20541多态性影响了该研究人群的气道高反应性和肺功能 [3]。综上所述，以上研究都证实了哮喘患者的遗传异质性[12]。

我们的前期研究已经证实哮喘患儿与非哮喘健康对照儿童比较支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）感染后，半乳糖凝集素-7（galectin-7）基因上调8倍[5]。孙丽华等人也发现哮喘组急性发作期和缓解期血清galectin-7水平显著高于健康对照组[6]。但是哮喘的发生机制研究中还没有关于galectin-7基因的报道。1995年Madsen及其同事在研究维持人正常表皮细胞表型的标记物时首次发现了半乳糖凝集素-7（galectin-7，GAL-7）[7]。Galectin-7还叫抑癌基因p53诱导基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表达在上皮细胞，特别是在复层上皮细胞，与细胞P53依赖性的凋亡，增殖，调控和分化有关。之后越来越多的研究发现galectin-7不仅影响肿瘤的发生，发展，在生理发育、免疫、炎症和代谢方面也有重要作用[8-15]。我们制作基因galectin-7沉默模型和该基因高表达模型，人为将该基因的表达提高或降低，从而探索该基因的表达水平的变化对气道屏障的作用及其与哮喘发生的关系。

参考文献：

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[6]孙丽华，张静，毛山。支气管哮喘患者血清半乳凝素-7水平的临床研究。临床误诊误治2012(12).

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[10]雒真龙 周鸿敏 徐立 等。Galectin-7蛋白在人非小细胞肺癌中的表达及临床意义 实用医学杂志2013年第29卷第21期（3466-3468）.

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（1）将galectin-7CDNA序列输入网上的基因沉默片断选择软件，选择沉默的发夹DNA。DEFINITION Mus musculus lectin, galactose binding,soluble 7 (Lgals7)CDNA

C A G C G A C T G G C CA C A T T G TGATGGAAAGGGAGGAGCTGAACCACTACCTTGCCTTTACTTAAGGTCCCCTCCCACAGCGACTGGCCACATTGTTGCTGTATTGCTGTGCCCGCCATGTCTGCTACCCAGCACAAGACCTCCCTGCCTCAGGGCGTCCGCGTGGGCACTGTCATGAGAATTCGAGGCATGGTCCCTGACCAGGCTGGCAGGTTCCATGTAAACCTGCTATGCGGTGAGGAGCAAGGAGCAGATGCCGCCTTGCACTTTAACCCGAGGCTGGACACTTCCGAGGTTGTCTTCAACACCAAAGAACAAGGCAAATGGGGCCGTGAGGAGCGAGGCACCGGCATCCCCTTCGAGCGTGGGCAGCCCTTTGAAGTGCTCCTCATCGCCACAGAGGAAGGCTTCAAGGCTGTGGTCGGGGATGACGAATATCTCCACTTCCACCACCGGATGCCGCCCGCGCGCGTGCGCTTGGTGGAGGTGGGCGGAGACGTGCAGCTGCATTCAGTGAAGATCTTCTAAGCAAGGACCCAAGGGCGTGGCGGGTAGGGGTGGGGGTGTAGGATCGCAGAGGAGGGTTTTGGATGGCGAATAAAGTGTAGCTGTAGTTCTG

（2）分别合成3个不同位置galectin-7CDNA的正义和反义发夹DNA。

（3）将正义和反义序列退火，并通过连接酶与基因沉默载体p-silencer5.1连接。

（4）通过酶切确定沉默载体构建完成

（5）通过细胞培养和基因沉默载体转染，检测不同发夹的基因沉默效率

基因沉默效率细胞水平上的Western检测

（6）选择沉默效果高的发夹，通过核基因注射把p-silencer5.1中的启动子和发夹基因转入小鼠的核基因（7）首建鼠仔代基因鉴定，利用PCR引物鉴定发夹基因是否转入。

基因沉默首建鼠PCR检测

上游引物5’ATCCTCCCTTTATCCAGC 3’

下游引物 5’ GAGGGCCTATTTCCCATG 3’

退火温度51度，产物大小392 BP

（8）首建鼠仔代Western Blot鉴定基因的沉默效果。

沉默鼠Western Blot检测

我们对该基因修饰小鼠进行质谱分析，注：野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7转基因小鼠（116#）。差异倍数≥1.2或差异倍数≤0.833，所得结果进入分析。共筛选出1009个差异蛋白。两两比较，已知蛋白如下表。发现Galectin-7的相关蛋白：细胞骨架类：肌球蛋白轻链3（Myosinlight chain 3）、肌球蛋白（Myosin-1）、肌动蛋白（Actin1）、肌钙蛋白C（TroponinC）、中间丝相关蛋白（Repetin）、角蛋白4（Keratin-4）,角蛋白13（Keratin-13）,肌集钙蛋白（Calsequestrin）、肌浆/内质网ATP酶钙（Sarcoplasmic/endoplasmicreticulum calcium ATPase）；物质转运：二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（Diphosphomevalonatedecarboxylase）；急性时相蛋白：α1-酸性糖蛋白2（Alpha-1-acidglycoprotein 2）或血清淀粉样蛋白A（Serumamyloid A protein）。

野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7转基因小鼠（116#）差异蛋白。

免疫共沉淀结果：发现在野生BALB/c小鼠，galectin-7转基因小鼠和galectin-7干扰小鼠中都存在Galectin-7，且在3组间都发现Galectin-7与肌球蛋白轻链-3，肌钙蛋白C，肌动蛋白-1，角蛋白-13和中间丝相关蛋白有相互作用。

野生BALB/c小鼠，galectin-7转基因小鼠和galectin-7沉默小鼠中gactin-7相互关联蛋白质

注：野生BALB/c小鼠（阴性组），galectin-7转基因小鼠（SPC组）和galectin-7干扰小鼠（Anti组）。

实验动物制备后在屏障环境繁育，3-4月龄脱颈椎处死，取肺组织进行检测。动物尸体统一放入冰柜处理。实验动物使用通过了医学实验动物研究所伦理委员会批准（ILAS-PG-2014-010）

我们通过野生BALB/c 小鼠、galectin-7转基因小鼠和galectin-7沉默小鼠进行的质谱分析、Western bloting以及免疫共沉淀，我们发现Galectin-7与细胞骨架蛋白质包括肌球蛋白轻链-3，肌钙蛋白C，肌动蛋白-1，角蛋白-13和中间丝相关蛋白相互作用，并参与细胞凋亡调控。有关Galectin-7在哮喘中的作用未见国内外报道，这些结果对于深入了解哮喘的发病机制有重要的意义，可用于哮喘的诊断和风险预测，并作为未来治疗的靶点。