基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型

一、疾病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、模型背景

1、病原信息

SIV是猴获得性免疫缺陷综合征（Simian Immune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，为典型的C型病毒粒子，基因组长度大约为9.2kb，基因组成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二个LTR以及同HIV类似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列顺序同HIV完全一样。目前国内外对SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因为这两个病毒株能在多种猕猴属动物身上引发致死性免疫缺陷综合征，同时伴有CD4+淋巴细胞下降，继发机会性感染病毒性脑膜脑病。这些都与人类AIDS类似。

2、实验动物背景信息

选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、研究背景

国内外普遍采用的艾滋病治疗策略是美国华裔科学家何大一在1996年提出的抗逆转录病毒疗法（HAART），该方法联合使用三种或三种以上的抗病毒药物抑制病毒的生命周期，俗称“鸡尾酒”疗法。WHO统计数据显示，目前有2169万HIV感染者接受了该疗法，占总感染人数的59%。患者通过HAART治疗可以有效减少病毒的复制，抵御病毒在体内传播，将血浆中的病毒RNA抑制在检测水平以下，从而延长患者生命，降低发病率和死亡率。由于尚无有效的艾滋病疫苗问世，抗病毒药物在预防HIV传播中亦起着极其重要的作用。目前国际上广泛接受U=U（Undectable= Untransmissible）概念。同时，药物也被用作高危人群的暴露前预防（PrEP）策略。然而，目前的抗病毒药物不能从体内清除病毒，HIV感染者需要长期甚至终生用药，一旦停药，体内的HIV将迅速反弹。

基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染动物模型的成功建立，可以深入研究该类药物在动物体内潜伏病毒的变化情况，有助于了解病毒储存库的形成、组织分布及定量情况，为潜伏库清除策略的研究奠定基础。该模型能更好地用于功能性治愈相关治疗策略的效果评价。

1、实验材料：SIVmac239病毒；选用体重4-6 kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

2、 静脉途径SIV恒河猴感染模型制作方法：

先用宠物用电推剪推去猴上肢采血部位的猴毛，左手抓住一侧后肢跗关节部位，使后肢皮下静脉怒张。用75%酒精酒精棉球消毒。右手拿吸取病毒液的注射器，针头沿静脉平行方向向向心端刺入血管，见回血后，左手放松，不再紧压，右手缓慢将病毒液推入。完毕后用干棉球压迫止血，将注射器拔出，弃在利器专用桶内。

3、 给药方法：将建立稳定的SIVmac239慢性感染的恒河猴，经皮下注射TFV/FTC/DTG，每天给药一次，连续给药6个月。

4、 样本收集和检测：定期收集外周血样本，提取病毒RNA和病毒DNA，测定血浆病毒载量、总病毒DNA、ALU-PCR和Q-VOA。

1、血浆病毒载量变化情况：

SIV成功感染恒河猴后，造成血浆病毒血症。通过给予抗逆转录病毒疗法（HAART），将血浆病毒载量抑制在低水平或基本检测不到的水平。停止HAART治疗，血浆病毒载量出现反弹。

图1 基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型的血浆病毒载量结果

2、免疫检测指标情况：

SIV感染恒河猴在疾病慢性期血浆病毒载量高；经HAART治疗后，3只猴的血浆病毒载量均呈低水平复制。停药之后，血浆病毒载量出现反弹。SIV感染恒河猴LIA 2和LIA 3的CD4细胞数明显上升。停药之后，CD4细胞数会再次减少。SIV感染恒河猴LIA 2和LIA 3的在进行药物治疗后，随着病毒载量的降低，CD4/CD8比值升高。停药CD4/CD8比值降低。

图2 基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型的免疫检测指标结果

SIV感染恒河猴在疾病慢性期CD4持续下降；经HAART治疗后，血浆病毒载量呈低水平复制，同时CD4细胞数明显上升。停药之后，CD4细胞数会再次减少。有些个体在慢性感染阶段出现CD4/CD8比值倒置，在进行药物治疗后，随着病毒载量的降低，CD4/CD8倒置现象缓解，停药后可能再次出现CD4/CD8倒置。有些个体在疾病不同阶段会腹泻、厌食、体重减轻等临床表现，其临床表现与药物治疗相关。

图3 基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型血浆病毒载量与免疫检测指标结果比对

3、发病过程比较：

建立的潜伏感染动物模型与人类有着相似的艾滋病发病过程。在感染艾滋病毒后会经历急性期，大约为50天。攻毒50天之后便进入慢性感染阶段。经历了约70周的慢性感染阶段，给与感染猴20周HAART药物治疗。感染动物的发病过程也与是否进行药物治疗有关。不同疾病阶段的临床表现不同。

图4基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型与临床发病过程模拟结果

表1基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型与艾滋病患者临床表型比对

4、病毒DNA和整合病毒DNA变化情况：

药物治疗期间一直可以检测到病毒的Total DNA。在治疗前，通过Alu-PCR定性检测，判断3只感染猴中有整合的病毒DNA存在。在治疗过程中，应用建立的Alu-PCR定性检测，发现3只感染猴体内一直存在整合的病毒DNA。

图5基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型总病毒DNA和整合性病毒DNA结果

5、具有复制潜能的定量病毒生长检测（Q-VOA）

感染猴在HAART药物治疗过程中，血浆病毒载量降低到现有水平的检测线下。通过QVOA检测，发现外周血的Resting CD4+细胞中存在具有复制能力的病毒，这些病毒在药物治疗期间潜伏在宿主细胞中。

图6 基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染恒河猴模型Q-VOA结果

1. 卫生部办公厅2012年9月26日发布的卫科教函【2012】287号，批准医科院动物所动物生物安全三级实验室（ABSL-3）从事高致病性病原微生物实验活动资格，其中，包括HIV-I型和HIV-II型，SIV及SHIV。

2. 本实验所用的SIVmac239病毒，在研究所已完成风险评估，具有完整的标准操作程序，全部动物实验活动在ABSL-3实验室中进行。

3. 本次申报的新资源“基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染恒河猴模型”在实验过程中严格遵守研究所生物安全规章制度和动物实验规章制度，遵循SHIV病毒风险评估和标准操作程序。

4. 感染动物实验的开展获得IACUC委员会批准（IACUC号：XJ19005）。

1、基础研究：基于HAART治疗的艾滋病潜伏感染模型的建立，可以深入了解药物治疗后，动物体内潜伏病毒的变化情况。该动物模型的建立便于研究药物治疗后病毒储存库的形成、组织分布以及定量研究，为潜伏库清除策略的研究奠定基础。

2、应用评价：该模型可用于研究HAART疗法中不同药物配伍的效果评价以及对病毒储存库的影响，为指导临床上艾滋病的治疗方案提供依据。该动物模型可以用于功能性治愈相关治疗策略的效果评价。