治疗后结核潜伏及再发的短程小鼠模型

一、疾病概述

结核病是由结核分支杆菌感染后所致的疾病，结核分支杆菌感染后约90%以上的人群不发病，呈隐性感染，即潜伏感染，约10%的人群感染后形成活动性结核病，多见肺结核，少量人群出现结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、肠结核、骨结核、淋巴结核和眼结核等。

肺结核的临床表现较为明显，有咳嗽咳痰，午后低热盗汗，严重者有咯血等表现，通过结核菌素的皮试阳性，痰菌培养阳性以及胸片学变化可以诊断肺结核。对于一部分痰培养阴性的结核患者，综合临床变现、皮试、胸片结果及其他血液学和免疫学指标辅助诊断，特殊情况下可以进行治疗性诊断。

Dannenberg等将结核菌感染和发病的生物学过程可分为起始期、T细胞反应期、共生期和细胞外繁殖传播期。侵入呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。细菌在肺泡巨噬细胞内存活和复制，便扩散至邻近非活化的肺泡巨噬细胞和形成早期感染灶。否则若被杀灭，则不留任何局部证据。在T细胞反应期，结核菌在巨噬细胞内的最初生长，形成中心呈固态干酪坏死的结核灶，它能限制结核菌继续复制。由T细胞介导的细胞免疫（cell mediatedimmunity，CMI）和迟发性变态反应（delaytype hyperensitivity，DTH）在此形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。大多数感染者发展至T细胞反应期，仅少数发生原发性结核病。大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪性中央部位被认为是持续存在的主要场所。低氧、低pH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖，大量结核菌从液化干酪灶释放形成播散。

活动性结核通过标准的短程化疗可以治愈，然而由于治疗期较长，有些病人并不能很好的坚持全程化疗，在治疗一个月后，结核的症状基本消失，但是机体中依然潜伏有少量结核菌，机体免疫正常时，可以在较长时间内都不出现症状发病，当机体抵抗力下降时，潜伏在体内的结核菌大量复制增殖，表现为结核病的再活动。

二、模型背景

1、结核菌菌株信息

本模型所用的病原菌为结核菌标准株H37Rv，是国际公认的模型用菌株，该菌株为单细胞克隆，基因序列已知，对抗结核药物敏感。

2、实验动物背景信息

本模型所用的实验动物为C57BL/6小鼠，SPF级，4-6周龄的雌性小鼠。C57小鼠对结核菌比较敏感，并且该品系小鼠是很多基因工程小鼠的背景小鼠，便于进行结核病的机制研究。此外，小鼠作为实验动物，相应的免疫试剂比较齐全，而且动物成本相对较低，饲养的空间要求较其它实验动物低，易于开展实验。

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

治疗后潜伏感染及再发的模型，主要模拟临床上活动性结核病人治疗后，症状消失，但是未彻底清除体内潜伏结核菌，当机体免疫力降低时，潜伏的结核菌复燃，结核病再活动的病人。该模型，不仅可用于潜伏感染的疫苗评价，潜伏期预防性治疗的药物和方案评价，还可以通过比较不同感染期，研究潜伏感染的早期诊断分子，疾病再发的机制。

目前，国内外报道的治疗后潜伏及再发的小鼠模型，即Cornell模型，该模型周期较长，潜伏期的组织菌量较高，可达到103以上的数量级，不能很好的模拟人群中潜伏的状态，此外，潜伏期后再发的时间和水平存在组内个体差异大的问题，因此，已有的模型需要优化，以便更能模拟潜伏和再发的状态，同时尽量使模型的组内均一性提高，缩短模型的周期，便于实际应用。

参考文献

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[6]林树柱,董娜,向志光,徐艳峰,占玲俊,马春梅,秦川.结核分支杆菌低剂量感染小鼠模型的建立与分析[J].中国防痨杂志,2012,34(12):817-820。

（一）实验材料

1. 试剂

1）LEAFTM Purified Anti-Mouse TNF-α(Biolegend，美国)

2）Isoniazid(Sigma，美国)

3）苏木精-伊红染料（HE染料）

5）0.01M PBS等

6）FBS（Life TechnologiesCorporation，USA）

8）4%多聚甲醛

9）75%医用消毒酒精（北京贞玉民生药业有限公司）

10）分支杆菌药敏罗氏培养管中性罗氏培养管（珠海贝索生物技术有限公司，中国）

11）Trizol（Invitrogen）

12）二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）

13）一次性无菌培养皿（康宁 ）

14）眼科剪（经高压灭菌）15）眼科镊（经高压灭菌）16）EP管（1.5mL）（Axygen）

17）胰岛素注射器（BD,美国）

18）1mL注射器（双鸽，中国）

19）组织研磨器（美天旎，德国）

2. 仪器设备

1）数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)

2）NanoZoomerS60明场荧光切片扫描仪（日本）

3）温控水浴锅(北京市六一仪器厂)

4）超低温冰箱(三洋，日本)

5）低温高速离心机(BECKMAN，美国)

6）台式离心机(上海安亭离心机厂)

7）可调微量1ml, 200ul, 100 ul, 20ul, 10 ul移液器(Gilson公司)

8）Ⅱ级生物安全柜（哈尔滨东联哈尔）

9）涡旋振荡器（QILINBEIER,QL-861）

10）960 Bacteria MGIT系统（BD，美国）

11）细菌超声分散计数仪（广东体必康生物科技有限公司，中国）

12）高速低温离心机（Thermo Scientific）

13) 组织研磨器（美天旎，德国）

14）电子天平（Ohaus Corp·PineBrook，USA）

15）组织脱水机（Leica）

16）石蜡包埋机（Leica）

17）石蜡切片机

18）电磁炉

（二) 实验设计

（三）动物感染和取材 固定小鼠于小鼠固定器中，暴露小鼠鼠尾，用75%酒精棉球擦拭鼠尾以暴露尾静脉， 以1.0×107CFU/mL的 H37Rv 200uL/只尾静脉感染C57BL/6小鼠，两周之后给予异烟肼（10mg/kg）连续治疗四周，之后TNF-α抗体（50ug/只/周）诱导四周。每个时间点各组分别取4只小鼠脱颈椎处死，解剖取脾脏、肺脏、肝脏组织进行荷菌量的检测和病理分析，所有的实验均在生物安全3级实验室（ABSL-3）进行操作。

（四）组织荷菌量检测 （1）生物安全柜中，用眼科镊取左侧肺组织、脾头1/3及肝靠腹背部的小叶部分用于组织研磨。 （2）组织依次用生理盐水、4%硫酸和生理盐水漂洗，加1mL生理盐水到研磨器中研磨，各组织研磨的匀浆液分别取100μL，用生理盐水按照1：10的比例进行梯度稀释5个浓度梯度，分别是10-1，10-2，10-3，10-4，10-5。 （3）取合适的三个稀释度的组织稀释液50或100μL，接种在分支杆菌中性罗氏培养管中，使组织研磨液能够充分的被固体培养基吸收，每个梯度各接种3管。 （4）将接种好的组织培养基的罗氏固体培养基置于斜面上，之后置于37℃，5%CO2的培养箱中，培养4周进行菌落计数。 （五） 组织病理分析 余下的脾、肺、肝组织置于4%中性甲醛固定液中固定一周后，脾脏和肝脏组织分别按长轴最大横切面进行修块，肺组织完整分离小肺叶。 按照常规石蜡切片制作方法包埋、修块、制片，HE染色后分析组织病理病变，HE片用NanoZoomer S60明场荧光切片扫描仪进行明场半自动扫片，扫完的HE片子用专用固态硬盘拷出，用VDP.View 2软件对病变组织进行定量分析。 病理诊断和分析由至少两名病理资深诊断专家采取双盲方法读片和给出报告。分析单位面积（mm2)的肺组织中肉芽肿面积，单位面积（mm2)脾脏内白髓内肉芽肿的面积，单位面积（mm2)肝脏内肉芽肿个数。 （六）数据分析 所有数据均采用均数±标准差(`x±s ) 表示。采用统计软件Graphpad prism 7进行统计分析。结果采用单因素方差分析( One-way ANOVA)，t检验和Tukey 检验分析组间差异是否显著，P <0.05认为差异有显著性。

1. 荷菌量检测结果

结核活动性感染的第二周，采用异烟肼治疗4周，4周后进入潜伏期，肺脾肝荷菌量为0，治疗后自然复发及诱导复发后肺脾肝荷菌量明显升高，其中诱导后复发水平更高，以活动期的同期肺荷菌量为对照（control）。在感染不同阶段检测肺脾肝组织的荷菌量值与个感染期的菌复制标准吻合。其中肺组织荷菌量为判断的主要标准，结果如下：

图2 潜伏期和再发期肺组织的荷菌量

左图：肺组织的潜伏期荷菌量的对数，右图是复发期各组的肺组织荷菌量。**P<0.01,***P<0.001

2. 病理病变结果

结核活动性感染的第二周，采用异烟肼治疗4周，4周后进入潜伏期，肺脾肝病理病变明显减轻，治疗后自然复发及诱导复发后肺脾肝病变加重，其中诱导后复发水平更明显，以活动期的同期肺病变为对照（control）。在感染不同阶段检测肺脾肝组织病变评分与个感染期的菌复制标准吻合。其中肺组织病变为判断的主要标准，结果如下：

图3 潜伏期和再发期肺组织的病变评分

左图：肺组织的潜伏期肺病变评分，右图是复发期各组的肺病变评分。**P<0.01,***P<0.001

3. 模型的评价

本模型采用的评价主要采取以整体表观效度的评价方法，核心指标是每个感染期的组织病变和荷菌量，根据结核病的不同感染期标准的参数来评估。比如小鼠感染后前两周，表现为活动性结核模型，肺脾肝组织有明显的病变，荷菌量达到104CFU以上，用抗结核药物治疗一个月后，与临床上治疗对应，小鼠中活动性结核菌被杀灭，剩余的菌潜伏在肺脾肝组织中，表现为组织荷菌量呈极低水平，有些小鼠的荷菌量可为0值，与此同时，肺脾肝组织的病变减轻，表现为轻微炎症或无明显病变，综合组织荷菌量和病变指标，可以判断此阶段较好的模拟临床上潜伏感染状态。值得注意的是，该阶段与治愈的区别在于，潜伏后小鼠可以自然或通过诱导剂引起肺脾肝组织中结核菌复燃，结核再活动，表现为荷菌量反弹升高，呈现明显的病变。

4.模型的验证

通过设置无治疗的感染对照组，以及无诱导剂的对照组，可以判断，治疗后小鼠处于潜伏期，诱导后潜伏的结核菌可导致结核的再发。

另外的实验，通过设置不同的治疗方案，比如单用抗结核化疗药异烟肼，以及异烟肼搭配免疫制剂PD-L1抗体，与对照组比较，综合判断复发期的起始时间点、荷菌量水平、病变程度，来确定治疗效果。

本模型已至少通过3个批次的实验来重复验证，参数指标稳定。

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

该模型的主要评价指标为不同感染期的肺脾肝荷菌量和病变评分值，该模型与国内外报道的经典cornell模型类似，但是cronell模型的问题在于模型潜伏期荷菌量过高，复发期3-9个月后不等。本模型不断的摸索尝试克服以上问题，模型均一，参数指标稳定，各感染期的荷菌量值水平合适（不过低也不过高），周期明显缩短，由3-9个月不等的周期缩短到比较稳定的10周，便于应用。

该模型不仅可以用于潜伏及复发的早期诊断分子的研究，还可以利用潜伏及复发期研究疾病机制，同时可以用于评价潜伏感染的预防性抗生素效果，以及治疗性疫苗的效果。