黑色素瘤GPR68 Ko小鼠皮下移植瘤模型

一、疾病概述

黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。

二、模型背景

1、基因信息

Description：Gprotein-coupled receptor 68（GPR68）

[Source：MGI Symbol；Acc：MGI：2441763]

Synonyms：Ogr1，OGR1，BB131428

Location：Chromosome12：100,876,682-100,908,198reverse strand.

Gene ID: 238377

2、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

GPR68（G-proteincoupled receptor 68）最初是从卵巢癌细胞HEY中克隆的G蛋白偶联受体（G-proteincoupled receptors，GPCR），其与G蛋白偶联受体4（GPR4），G2积累受体（G2A）及T细胞死亡相关基因8受体（TDAG8）有40%到50%的同源性，同属一个GPCR亚家族[1]。研究发现GPR68是质子激活受体，能通过受体上的组氨酸残基感知细胞外的质子或pH，进而刺激三磷酸肌醇（IP3）的产生，释放细胞内的钙离子[2]。但GPR68下游的信号通路却并不清楚，其相关信号通路的生理作用也鲜为人知。GPCR家族的其它3个成员也被发现是感知质子的受体，被质子激活后，通过异三聚体G蛋白中的Gα（Gα(s)，Gα(i)，Gα(q)和Gα(12/13)），可以激活一系列的细胞内信号通路[2,3]，见图1[4]。

GPR68在胸腺，脾，肺，小肠，结肠，外周血白细胞中均有表达[1]，GPR68在免疫相关的细胞，特别是在CD4+和CD8+T细胞中表达最高[5]。前期研究中发现，敲除GPR68能抑制小鼠前列腺肿瘤和黑色素瘤的发生和发展，且这一抑制作用需要T细胞的直接参与[5,6]。GPR68可能在肿瘤的酸性环境中抑制T细胞的功能，质子通过激活GPR68抑制T细胞的迁移和增殖。因此，若通过阻断GPR68的功能能够提高T细胞在肿瘤微环境中的活性，那么在用于肿瘤免疫治疗的T细胞中阻断GPR68，则能增强过继转输T细胞对肿瘤的治疗效果。

综合前期研究基础，利用GPR68敲除小鼠模型、T细胞功能性实验以及其他生化实验方法，从体内、体外和分子机制等层面深入研究GPR68在T细胞中的功能，特别是GPR68对T细胞抗肿瘤免疫的影响，并通过筛选抑制和激活GPR68靶点的小分子，探寻调节GPR68信号通路的途径，将为肿瘤的T细胞免疫治疗提供新的思路，并为以GPR68为靶点的肿瘤免疫治疗打下基础。

图1OGR1介导的信号通路:OGR1感知细胞外质子,导致cAMP信号传导途径的激活，OGR1通常通过Gq/11蛋白与PLC/Ca2+途径偶联。

参考文献

[1]XuY, Casey G. Identification of human OGR1, a novel G protein-coupled receptorthat maps to chromosome 14. Genomics. 1996;35:397-402.

[2]LudwigMG, Vanek M, Guerini D, Gasser JA, Jones CE, Junker U, et al. Proton-sensingG-protein-coupled receptors. Nature. 2003;425:93-8.

[3]ImDS. Two ligands for a GPCR, proton vs lysolipid. Acta Pharmacol Sin.2005;26:1435-41.

[4]LiWS, Liu HF, Yan LB, et al. OGR1 and the tumor microenvironment.Chin J CompMed,2019,29(7):96-101.

[5]LiH, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z, et al. Abnormalities inosteoclastogenesis and decreased tumorigenesis in mice deficient for ovariancancer G protein-coupled receptor 1. PloS one. 2009;4:e5705.

[6]YanL, Singh LS, Zhang L, Xu Y. Role of OGR1 in myeloid-derived cells in prostatecancer. Oncogene. 2014，33, 157–164.

（一）GPR68 Ko小鼠的构建

1、实验设计

根据GPR68蛋白保守区和基因组结构，设计需要删除的外显子。GPR68基因存在多种转录产物，但根据GPR68基因组结构和蛋白功能保守区，只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将exon1进行全身性敲除。

图2 插入位点设计

2、Cas9/gRNA的活性检测

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测內源活性。根据Cas9/gRNA的內源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。

3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配

选取活性高的CRISPR体外转录成RNA，显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建者小鼠（founder）。对小鼠进行基因型鉴定，获得发生期望突变的founder小鼠。通过基因组DNA的PCR进行基因型的鉴定，若发生DNA片段删除，将出现特异的缩短的PCR产物。

4、稳定遗传的Gpr68敲除小鼠品系的建立

将带有突变的founder小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠（+/-）F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生的DNA片段删除，从而目标蛋白被失活，实现基因敲除。

基因型相同的杂合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的纯合子小鼠（-/-）F2代。大约有1/4几率的F2后代小鼠是基因敲除的纯合体小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的构建

1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。

2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。

3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。

4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。

5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。

在无特殊刺激的情况下，GPR68-/-小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测GPR68-/-小鼠组织中GPR68表达，如图3所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。

图1 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达

a.鼠尾DNA的鉴定；b.脾脏T细胞的mRNA鉴定；c.脾脏T细胞的蛋白鉴定

分别对WT与GPR68-/-小鼠进行皮下注射接种5×105个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。如图4所示，与WT小鼠比较，GPR68-/-小鼠能够明显抑制黑色素瘤的发展，GPR68-/-小鼠脾脏增大，但二者体重无明显差异。

图2 GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用

a. 小鼠体重曲线；b.肿瘤生长曲线；c.肿瘤大小；d.肿瘤重量；e.脾脏重量

GPR68敲除小鼠由北京唯尚立德生物科技有限公司设计并制备，杂合子自交构建纯合子由本科室在SPF级饲养环境中完成，经DNA鉴定该基因特征能够稳定遗传。

在无特殊刺激的情况下，GPR68敲除小鼠没有明显表型，其表型与野生型C57BL/6J小鼠无明显差异。GPR68敲除小鼠饲养于SPF级环境中，机体内无特定的病原微生物和寄生虫存在。

全身性GPR68敲除小鼠的各组织器官、细胞的DNA、mRNA、蛋白中均检测不到GPR68表达，证实构建成功。通过黑色素瘤皮下成瘤实验，证实本课题组构建的GPR68敲除小鼠与国外的同品系动物表型一致，均能够对肿瘤的发生发展产生抑制。

前期研究显示T细胞表达高水平的GPR68，可能介导了肿瘤酸性微环境对T细胞的抑制作用，但是GPR68在T细胞中的具体功能以及如何介导了酸性pH对T细胞的抑制作用尚不清楚，其机制有待进一步研究。

肿瘤免疫治疗需要抑制机体的免疫耐受，激活免疫细胞（主要是T细胞），增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，而肿瘤的微环境（包括酸性pH）是减弱免疫治疗效果的重要原因。GPR68在T细胞中的表达以及对肿瘤的发生发展的影响是全新的发现，研究GPR68在T细胞中的功能，特别是GPR68对T细胞抗肿瘤免疫的影响，将为肿瘤的T细胞免疫治疗提供新的思路。并且，GPR68敲除小鼠在正常生理条件下无异常表型，以此推测若在体内用药物抑制GPR68可能不会引起严重的生理问题，副作用相对较小，因此GPR68可能是很好的药物靶点。