心脏组织特异性过表达CYP2E1转基因小鼠模型

扩张型心肌病以心腔扩张、心肌收缩功能受损为主要特征，其为原发性心肌病的主要类型，临床表现包括进行性心力衰竭，心律失常，气短及水肿。扩张型心肌病是除冠心病和高血压以外导致心力衰竭的主要病因之一，至今，除行心脏移植外，扩张型心肌病仍无特异有效的治疗方法，其主要是对症治疗，但随病情进一步发展，心衰加重最终导致死亡，其病症出现后5年存活率约为40%。

扩增并经测序比对正确的CYP2E1片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达CYP2E1表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型，Western Blot分析CYP2E1蛋白的表达情况（图1）。

图1. CYP2E1转基因小鼠的建立及鉴定

CYP2E1表达载体构建图(A)及Western Blot分析CYP2E1蛋白的表达情况(B).

1. CYP2E1转基因小鼠从3月龄开始出现死亡，Spss16.0软件Kaplan-Meier curves分析显示，至9月龄时CYP2E1转基因小鼠死亡率为13.75%，而cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠模型的死亡率为17.5%，与野生小鼠相 比，死亡率皆显著增高（图2, P < 0.01）。

图2. CYP2E1转基因小鼠生存率分析

至9月龄时, 野生对照小鼠（n=80）无死亡发生, 经Spss16.0软件Kaplan-Meier curves分析, cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠（n=40, *P < 0.01）及CYP2E1转基因小鼠死亡率显著性增加（n=80, *P < 0.01）.

2. CYP2E1转基因小鼠心室扩张和收缩功能下降，心肌细胞排列不齐，间质纤维化增加，表现出与cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠相似的病理表型（表1及图3）。

表1. 5月龄CYP2E1转基因小鼠超声参数

LV: 左室; LVIDd: 左室舒张末期内径; LVISd: 左室收缩末期内径; LVPWd: 左室舒张末期后壁厚度; LVPWs: 左室收缩末期后壁厚度; LVAWd: 左室舒张末期前壁厚度; LVAWs: 左室收缩末期前壁厚度; Ejection fraction%: 射血分数; Fractional shortening%: 短轴缩短率. *P <0.01 versus WT.

图3. CYP2E1转基因小鼠心脏组织学分析

CYP2E1转基因小鼠心脏切片H&E染色整体(A)及高倍(B)截图, 心脏切片Masson染色(C),心肌组织Col3a1表达(D)及灰度扫描定量分析(E, n=3,*P <0.01 versus WT)

3. CYP2E1转基因小鼠心肌组织氧化应激指标H2O2，MDA的表达显著增高，而抗氧化指标GSH和T-AOC的表达显著降低，与cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠表达趋势相似（图4, P <0.01 versus WT）。

图4. CYP2E1转基因小鼠心肌组织氧化应激参数分析

5月龄时CYP2E1转基因小鼠（n=12）, cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠（n=12）及对照小鼠（n=12）心肌组织中氧化应激参数H2O2，MDA，GSH和T-AOC的表达分析, *P <0.01 versus WT.

4. CYP2E1转基因小鼠心肌组织中线粒体依赖凋亡通路中caspase9,3的表达及细胞色素c的释放显著增加（图5A-F,n=3, *P <0.01 versus WT），心肌细胞凋亡显著亦增加（图5G-H,n=3, *P <0.01 versus WT），表现为与cTnTR141W扩张型心肌病转基因小鼠类似的表型。

图5. CYP2E1转基因小鼠心肌细胞凋亡分析

Western blot 法分析CYP2E1转基因小鼠心肌组织中caspase 9,3和细胞色素c的表达(A)及灰度扫描定量分析(B, n=3, *P <0.01 versus WT), CYP2E1转基因小鼠心脏组织切片TUNEL染色(G)及凋亡细胞定量分析(H, n=3, *P <0.01 versus WT).

实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(GC08-2027)。

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。