东莨菪碱诱导老年痴呆症小鼠模型

痴呆为一种后天获得性智能障碍综合症，是指意识清晰的病人，由于大脑器质性或代谢性病变造成的持续性、进行性智能衰退。老年性痴呆系指65岁以上老年人患有的痴呆。主要有阿尔茨海默痴呆（AD）和血管性痴呆（VD）。阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。由德国神经病理学家Alois Alzheimer于1906年最先描述。

临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，通常表现为一组症候群，一般具有慢性或进行性的特点，出现多种脑高级皮质功能的紊乱，其中包括：记忆、思维、定向、理解、计算、学习能力、语言和判断功能等，偶尔以情绪控制失常和社会行为异常为前驱症状，其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白 (β-amyloid，β-AP)沉积，神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles，NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque，SP) 的形成。传统上认为胆碱能递质缺乏是老年性痴呆的主要原因。老年性痴呆患者认知功能损伤与脑内神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine, Ach）水平下降密切相关。采用M胆碱受体阻断剂东莨菪碱（scopolamine, SCOP），使脑内Ach水平显著下降，可稳定诱导学习获得障碍，其操作简便，被广泛应用于防治老年性痴呆药物筛选及评价。

早期症状包括：（1）记忆：记忆力减退；时间和定向力减退；思维和判断力减退。（2）行为：丧失主动性，缺乏生活和工作热情；情绪淡漠或变得易于紧张和激动。（3）日常生活能力：需要更长的时间完成以前能胜任的工作和家务。晚期表现：（1）记忆：记不清家人和镜子中的自己；不能写出自己的名字，不会简单的加减法；不能用语言进行沟通；（2）行为：身体出现抽搐，伴有吞咽困难及肢体僵硬，最后将卧床不起；穿衣吃饭等行为十分异常；（3）日常生活能力：几乎完全丧失生活自理能力：自己不能控制大小便。伴随症状-精神及行为异常：幻觉、妄想、抑郁、躁狂、焦虑、睡眠。

健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，8周龄，购自中国医学科学院实验动物中心。常规饲养。

1.药品的制备

实验前，以0.9%的生理盐水溶解东莨菪碱，配制0.1mg/mL（或其他所需浓度）的溶液。溶液配制需在避光条件下完成，且溶液需置于棕色瓶中暂时储存。

2.造模方法

适应性饲养3天后，根据随机表将小鼠随机分为5个组：正常组、SCOP各剂量组（0.25、0.5、1、2 mg/kg/d），于每次行为学检测前半小时腹腔注射不同剂量SCOP进行造模，给药体积为0.2ml/10g。

3. 模型分析指标

（1）自主活动测试 小鼠自主活动实时检测分析处理系统进行自主活动实验，检测时，将小鼠沿壁放入将小鼠置于测试箱适应2~ 3min后，设定参数后开始实验。软件自动采集分析动物10 min内运动轨迹，通过总路程、平均速度、运动总时间、静息总时间反映动物自主活动情况。

（2）水迷宫实验（Morris water maze）

水迷宫空间记忆

迷宫分为 4 个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径， 空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余 3 个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练 3 次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从 3 个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应 10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为 60s 后，将动物放入水中，若动物在 60 s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息 10 s。若动物在 60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为 60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留 10 s。每只动物训练的时间间隔为 40 min。每天每只动物 3 次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过 5d 的训练学习后，第 6 天撤去平台， 进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在 60s 内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

1. 不同剂量SCOP对小鼠自主活动的影响

结果如图1所示，腹腔注射系列浓度SCOP后，SCOP各剂量组总路程均较正常组明显升高，呈剂量依赖关系，随着检测时间延长，总路程逐渐减少。各组在腹腔注射SCOP 35min后自主活动度基本趋于稳定。

图 1 东莨菪碱对C57BL/6J 小鼠自主活动的影响

(n=8，means ± SEM). * P<0.05, ** P<0.01 和对照组相比

2. 不同剂量SCOP对小鼠空间学习记忆的影响

如图2所示，各剂量SCOP均能明显损害小鼠空间参考记忆能力，呈剂量依赖性，表现为定航实验中，潜伏期和总游程显著延长、游出率明显减少，小鼠游泳的平均速度也受到明显影响。其中SCOP 1 和2 mg/kg对空间记忆能力损害最为明显，SCOP模型小鼠的搜索策略为典型的边缘型搜索，训练4天时间几乎没有小鼠寻找到平台。

而由于水迷宫直径为130cm，对于小鼠来说，难度太大，在空间探索实验中，正常组小鼠成绩并不理想，SCOP模型组与正常组比较，穿台次数、原实台象限游程比和时间比均无显著性差异（图3）。

图2 东莨菪碱在水迷宫实验中对空间参考记忆的获得的影响

(A)逃避率 (%). (B) 总路程(cm). (C) 逃避潜伏期 (sec). (D) 平均速度(cm/s). * P<0.05, **P<0.01 和对照组相比.

图3 东莨菪碱在水迷宫实验中对记忆保留的影响

（n=8，mean±S.E.M）(A) 穿台次数 (B) 目标象限停留时间 (%)

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。