小鼠肺癌LEWIS绿色荧光标记细胞C57/BL小鼠模型

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。因此应该提倡不吸烟，并加强城市环境卫生工作。

一 肺癌的临床表现比较复杂，症状和体征的有无、轻重以及出现的早晚，取决于肿瘤发生部位、病理类型、有无转移及有无并发症，以及患者的反应程度和耐受性的差异。肺癌早期症状常较轻微，甚至可无任何不适。中央型肺癌症状出现早且重，周围型肺癌症状出现晚且较轻，甚至无症状，常在体检时被发现。肺癌的症状大致分为：局部症状、全身症状、肺外症状、浸润和转移症状。

目前认为吸烟是肺癌的最重要的高危因素，烟草中有超过3000种化学物质，其中多链芳香烃类化合物（如：苯并芘）和亚硝胺均有很强的致癌活性。多链芳香烃类化合物和亚硝胺可通过多种机制导致支气管上皮细胞DNA损伤，使得癌基因（如Ras基因）激活和抑癌基因（如p53，FHIT基因等）失活，进而引起细胞的转化，最终癌变。

肺癌是职业癌中最重要的一种。估约10%的肺癌患者有环境和职业接触史。现已证明以下9种职业环境致癌物增加肺癌的发生率：铝制品的副产品、砷、石棉、铬化合物、焦炭炉、芥子气、含镍的杂质、氯乙烯。长期接触铍、镉、硅、福尔马林等物质也会增加肺癌的发病率，空气污染，特别是工业废气均能引发肺癌。发达国家肺癌的发病率高，主要原因是由于工业和交通发达地区，石油，煤和内燃机等燃烧后和沥青公路尘埃产生的含有苯并芘致癌烃等有害物质污染大气有关。大气污染与吸烟对肺癌的发病率可能互相促进，起协同作用。

肺脏是对放射线较为敏感的器官。电离辐射致肺癌的最初证据来Schneeberg-joakimov矿山的资料，该矿内空气中氡及其子体浓度高，诱发的多是支气管的小细胞癌。肺结核、支气管扩张症等患者，支气管上皮在慢性感染过程中可能化生为鳞状上皮致使癌变，但较为少见。家族聚集、遗传易感性以及免疫功能降低，代谢、内分泌功能失调等也可能在肺癌的发生中起重要作用。许多研究证明，遗传因素可能在对环境致癌物易感的人群和/或个体中起重要作用。

小鼠肺癌Lewis细胞系广泛应用于转移瘤的研究，并且在肿瘤化疗药物研究中发挥着一定的作用。Lewis肺癌细胞系来源于C75BL小鼠初级Lewis肺癌移植瘤，该细胞系具有1,3-bis-(2-氯乙烯)-1-亚硝基脲抗性，但却对甲氨蝶呤敏感。报道称，该细胞系在小鼠中具有致瘤性，但转移率较低。该细胞在培养瓶中呈多层生长状态，检测发现该细胞系为鼠痘病毒阴性。

1921年C.C.Little用Lathrop小鼠作近亲培育时，用No.57雄鼠和No.52雌鼠交配，培育成C57。在C57中将毛色呈黑色的进行固定，培育成C57BL。1937年Little将维持的C57BL第六组亚系定名为C57BL/6，将第十组亚系定名为C57BL/10，继而分别维持至今。1947年从Little引入到美国JacksonLab.，形成C57BL/6J;1951年从JacksonLab.引到NIH，形成C57BL/6N亚系。六十年代到日本实验动物中央研究所，1986年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。2001年从美国再次引种。

动物外部特征为：黑色；

遗传基本组成：a/a,C/C:H-2b,Mup-1b,Ig-1b,T1ab(a/B/C/D/H-2b)

遗传概貌：符合国标GB14923－94标准

携带微生物情况：符合国标GB14922－94SPF级质量标准

繁殖性能：产仔率：89～95％ 平均窝产仔数：6.98～7.48只

胎间隔：28～36天 离乳存活率：87～93％

模型制作采用C57/BL小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

1 细胞培养：Lewis肺癌细胞为本实验室冻存

2 构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

3 细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染Lewis细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第4周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大（图1）。

该小动物模型饲养在清洁级动物中，微生物处于监控状态，动物房有相应的保护措施，小鼠不会出现逃逸，不会对外界环境造成影响。