慢性胃肠黏膜损伤树鼩模型

胃肠黏膜损伤导致的胃肠疾病是一种临床上常见的急、慢性消化系统疾病，常反复发作，给患者的身心健康带来极大的危害，建立理想的胃肠黏膜损伤性消化道动物模型，对探索该病的病因、发病机制、病变发展规律，明确治疗方法及研发新药均有积极意义。目前报道的胃肠黏膜损伤动物模型造模方法主要有:应激性造模、药物造模、乙酸或乙醇致胃溃疡模型等。早期有研究者采用能选择性破坏中脑黑质多巴胺能神经元的毒性物质 1-甲基-4-苯基-l，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)，腹腔注射大鼠后导致其胃、十二指肠黏膜损伤和溃疡。

1. 诱导剂准备

MPTP溶于生理盐水。

2. 实验动物

普通级雄性树鼩。

3. 给药

造模组和生理盐水对照组。造模组腹腔给与不同剂量的 MPTP溶液造模。成年健康雄性树鼩 12 只,随机分为 3 组，每组 4 只，分别为 2mg/kg 剂量组、1 mg/kg 剂量组和对照组腹腔注射等体积生理盐水，连续 56 d。

4. 模型分析指标

（1） 脑脊液中胺(dopamine)含量测定

56d后，采用1%戊巴比妥钠溶液按每100 g体重0.2 mL 剂量对树鼩腹腔注射麻醉，待树鼩麻醉后采集脑脊液，用液相色谱仪测量脑脊液中多巴胺(dopamine)含量。

1. 一般情况的观察

2mg/kg 剂量组腹腔注射MPTP[2mg/(kg·d)]后，其中有2只树鼩先后出现了一过性、暂时性的急性帕金森综合征症状(如:行动缓慢，反映迟钝，四肢无力，步态不稳，不能站立)，2只树鼩之间表现强弱略有细微差异，均在每天给药后持续约5 min左右，之后恢复正常。但上述帕金森症状是只有在腹44中国比较医学杂志2018年3月第28卷第3期 Chin J Comp Med，March 2018，Vol．28．No．3腔注射MPTP之后才会出现的急性症状，而且此症状持续一周之后就不再出现。其它指标和其它树鼩相同，即腹腔注射后至第3周末，精神状态、毛色、排粪尿正常，但食欲下降，活动量减少，第4周开始对照组逐渐恢复正常，模型组依旧活动量少，食欲明显下降，毛皮蓬松没有光泽，排粪时好时坏，部分

树鼩粪便呈黑色。

2. 树鼩体重变化情况

每周称量体重一次发现，1mg/kg剂量组和2mg/kg剂量组从开始至第8周体重均出现逐渐下降趋势;对照组从实验开始到第4周出现体重下降，第4开始逐渐上升直至恢复，如图1所示。

3. 树鼩脑脊液中多巴胺含量检测结果

多巴胺含量检测结果显示，模型组树鼩脑脊液多巴胺含量均比对照组树鼩的多巴胺含量明显减少(P＜0.05);1mg/kg剂量组和2mg/kg剂量组比较差异无显著性(P＞0.05)。提示注射MPTP能选择性破坏树鼩中脑黑质多巴胺能神经元，使树鼩脑脊液中多巴胺含量明显降低。(见表1)

4. 形态学观察结果

2mg/kg、1mg/kg剂量组肉眼均可见树鼩胃肠外形大小、颜色正常;也可观察到胃肠道表面布满淤血，内容物呈黑色。体视镜下两组均有不同程度的胃肠黏膜损伤，具体表现为，胃黏膜局部充血或有弥漫性出血点，内壁上多处红肿出血，覆盖白色苔状物(如图2B)，或胃黏膜部分轻微脱落，多处呈异样粉红色，内壁上有零星散在轻微出血点(如图2C)，胃窦与十二指肠则表现为正常无异样状况;也有十二指肠黏膜颜色略微加深，覆盖白色苔状物，壁上多处红肿出血，或有散在出血点(如图2D)。但两组在胃肠黏膜损伤程度上没有明显区别;对照组肉眼和体视镜下观察，4只树鼩胃、十二指肠均无异常表现，胃内容物少，胃肠黏膜完整清洁，结构完整，大小、形态、颜色均正常。结果见图2。

注:A:对照组胃内壁;B、C:实验组胃内壁;D:实验组十二指肠。

5. HE 染色结果

2mg/kg和1mg/kg剂量组大部分树鼩镜下见正常胃壁黏膜;胃体黏膜可见少许淋巴细胞及浆细胞浸润，部分表层黏膜脱落，少部分树鼩可见胃黏膜损伤明显，突出表现为黏膜下细胞水肿，部分胃黏膜结构紊乱，伴随有出血、脱落的坏死黏膜，或有粘膜上皮脱落，固有层充血，并有炎性细胞浸润，杯状细胞增多，粘膜下层充血水肿并有炎性细胞渗出，肌纤维间有大量炎性细胞浸润(如图3B);胃窦部胃小凹粘膜上皮脱离，固有层出血，并有炎性细胞浸润，胃腺杯状细胞增多，少许树鼩肠腺上皮细胞发生化生，粘膜下层充血，有炎性细胞渗出，肌层细胞发生变性坏死(如图3C);十二指肠粘膜上皮脱落，固有层充血，粘膜的杯状细胞增多，部分区域出现了炎细胞的慢性炎症改变，少许树鼩有固有层和粘膜下层的结缔组织增生，有多量淋巴细胞浸润(如图3D)，两组比较无明显区别。对照组树鼩胃肠主细胞、壁细胞形态正常，胃壁浆膜层、肌层、黏膜下层、黏膜层四层结构清晰完整，黏膜层腺体排列整齐。见图 3。

注:A:对照组胃体;B:实验组胃体;C:实验组胃窦;D:实验组十二指肠。

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。