MHCII类分子HLA-DP4人源化小鼠金葡菌肺部感染模型

主要组织相容性复合物(MHC)是一组决定移植组织是否相容、与免疫应答密切相关、紧密连锁的基因群。在人类中MHC被称为人类白细胞抗原(HLA)基因复合物。组成MHC的各种基因成簇的分布在人第6号染色体短臂，主要包含了HLA I类、HLA II类和HLAIII类基因，其中的HLA II类基因主要包括了HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR等三类基因簇，相应编码了HLAII类分子HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR等。HLAII类分子仅表达在成熟B细胞和抗原递呈细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，部分细胞在特殊分子诱导或者某些病理状态下可以表达II类分子。这些分子的主要功能是从细胞外将病毒抗原递呈给T细胞，特异性的抗原通过递呈后可以有效地刺激T细胞，协助刺激产特异性抗体的B细胞产生相应抗体，以杀死或抑制该特定抗原。

HLA-DP区域位于II类区域的着丝点端，全长75kb,包括有2个功能基因，2个假基因。其中DPA1和DPBl是经典的HLAII类基因，分别编码HLA-DP抗原分子的α、β链，这两个基因在基因组上是头对头排列的，即两个基因的5’端相向而立，两个基因的转录起始位点之间约间隔2．5kb的序列，是它们共同的调控序列。由于DP分子在细胞表面表达水平较低，因此是II类分子中最后被发现，而且也是研究最少的经典座位。在小鼠MHC中没有DP相应的抗原分子，这是人和小鼠MHC的一个显著差别。基于这些特征，DP区域可能与其他II类抗原分子有着不同的功能或者进化模式。

疾病相关性研究表明，DP分子与幼年类风湿性关节炎、铍中毒及遗传性过敏症相关。2009年，Kamatani等基于人类全基因组关联研究(genome wide association study，GWAS)，发现日本人群和泰国人群中HLA-DPA1及HLA-DPB1基因中的l1个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)位点与慢性乙型肝炎显著关联；随后研究也证实在中国、韩国以及沙特阿拉伯、高加索人群中HLA-DP基因簇上的11个单核苷酸多态性位点(SNP)与乙肝病毒感染相关。进一步研究表明，HLA-DPB1基因3’UTR多态性（rs9277534G）影响HLA-DPB1基因的表达水平，进而可能影响到人群自身免疫性肝炎易感性。

HLA-DP 基因座上的两 SNPs（rs2395309，rs9277535）在中国南北汉族人群中与 HBV 的感染和感染后清除均呈显著相关。在骨髓移植中，HLA-DPB1的匹配程度对无关供者骨髓移植的效果具有显著影响。但HLA-DP在免疫反应中的作用迄今尚未阐明。

HLA基因的表达调控与其他重要功能基因一样呈现出复杂的调控格局，更由于其重要的免疫学功能而表现出调控方式的特殊性。一般认为，HLA分子的表达调控主要在转录水平，受到了多个转录因子和其启动子区的顺式元件相互作用的影响。目前研究显示，除了一些近端调控元件W/S、X1、X2、Y盒等之外，上游远端的LCR（locuscontrol region）也被发现可与RFX和CIITA结合，对HLAII分子基因转录进行调控。在小鼠的H2Ea基因，甚至发现了位于基因上游20kb以外的调控元件。已经有报道显示5’UTR和3’UTR在HLA-DRA转录后水平的基因表达调控中发挥着重要作用，控制着mRNA的稳定性和降解速率，决定翻译速率和利用效率，而且还能对特定mRNA的时空性表达起重要作用。目前关于DP基因的表达调控研究较少。有限的资料表明，HLA-DPB1分子的表达调控不同于其他II类分子。类成淋巴细胞系45.EM2正常表达HLA-DQ、HLA-DR分子以及HLA-DPA1分子，但是不表达HLA-DPB1（Coiras等2002）。

转基因小鼠是研究MHC类分子基因表达及功能的重要研究工具。相对于DQ和DR基因座位点，DP基因座位点的人源化转基因小鼠模型较少。目前仅报道了三种DP转基因小鼠（HLA-DPB1*0401、HLA-DPB1*0201、HLA-DPB1*1701），用于人慢性铍疾病分子机理研究（Tarantino-Hutchison等2009，Mack等2014）。HLA-DP基因存在较多的遗传连锁不平衡现象。2013年2月WHO IMGT／HLA database (http：／／www．ebi．ac．uk／imgt／hla／，Release 3．11．0 )公布的HLA-DPA1和HLA-DPB1等位基因分别为36个和159个。但是，HLA-DPA1*0103/DPB1*0401 (DP401)和HLA-DPA1*0103/DPB1*0402(DP402)两个基因型分布在20-60%的全世界人群中，DP401和DP402共享相似的抗原决定簇（Castelli等2002，JUNBAO等2005，Sidney等2010）。且研究显示，HLA-DP4可以呈递来自流感病毒、HIV病毒、肿瘤细胞的多种多肽到CD4细胞（Castelli等2002，JUNBAO等2005，Cohen等2006，Sidney等2010）。

目前报道的HLA-DP人源化转基因小鼠整合人DP基因组片段最大为32kb。为了建立外源转基因的表达水平接近或达到原有的生理水平的动物模型，方便从动物整体水平研究DP基因的功能，我们建立了嵌合人HLA-DP基因组区域的人源化转基因小鼠模型。

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1. 采用常规技术，包括超数排卵、假孕鼠的制备、固定针和显微注射针的制备、显微操作技术等获得BAC人源化转基因小鼠HLA-DP401、HLA-DRA

2.菌液制备

（1） 从琼脂平板上挑取Newman菌株单克隆, 接种于无菌TSB液体培养基中，置于台式恒温振荡器37℃，200rpm振荡培养过夜，

（2）第2天再将过夜培养的菌液重新接种至新鲜配置的TSB 培养基中，菌液与TSB培养基体积比为1: 100（50μL菌液加入到5mL 的TSB培养基中）， 37℃，200rpm振荡培养过夜。

（3）当细菌长至对数期时（OD600=1），将菌液移入 EP管中，10000g离心10min，去上清收集细菌沉淀，用无菌PBS洗涤吹打细菌沉淀使其悬浮，再 10000g离心10min，去上清收集细菌沉淀，PBS洗涤2次，

（4） 然后用无菌PBS 悬浮细菌至 1×1010CFU/mL。

（5） 处于对数生长期的菌液与 50%的无菌甘油，以1:1的比例混合后放入-70℃冻存。琼脂平板存放于4℃冰箱。

3.细菌接种方法

接种细菌当天，将已经预先免疫抑制处理的小鼠腹腔注射0.1mL 已配制好的无菌0.5%戊巴比妥钠溶液，或气体麻醉（50ml离心管中），使小鼠处于麻醉状态后，固定在手术板上，腹部朝上，头微微往上抬，将准备好的菌液缓缓的从小鼠一侧的鼻腔滴入，每只小鼠滴入50μL的Newman 菌液。滴入完以后将小鼠立起1min，然后将其放置电暖气旁边，待苏醒后置于鼠笼，继续以正常条件饲养。

4.小鼠按体重随机分成

感染组 空白对照组

C57 感染组6-8 只 3-4只

HLA-DP-H2Aβ-KO 感染组6-8 只 3-4只

HLA-DRA-H2Aβ-KO 感染组6-8 只 3-4只

H2Aβ-KO感染组6-8 只 3-4只

空白组在麻醉后从鼻腔滴入50μLPBS；感染组在麻醉后从鼻腔滴入50μNewman菌液。

比较C57、HLA-DP-H2Aβ-KO、HLA-DRA-H2Aβ-KO、H2Aβ-KO这四种小鼠脾脏中各种免疫细胞，包括 CD4+ CD8+ CD3+（T细胞） CD19+（B细胞）F4/80+(巨噬细胞) CD11b+/Ly6G+（中性粒细胞）之间是否存在差异。

5. 测定指标：

（1）小鼠日常观察

观察模型组和空白组小鼠的活动状况、精神状态、饮水进食等情况。

（2）小鼠体重指标

在每个时间点，对模型组和空白组小鼠称量体重。

时间点：感染当天即为0天，感染后第一天，感染后第三天，感染后第七天为采样点。

（3）组织病理学观察

感染后1D, 3D, 7D三个时间点，每组取两只小鼠，处死后，取肺组织，分别称重，组织固定过夜后，30%蔗糖脱水48H，OCT包埋后制作冰冻切片，做H&E染色组织病理学检测。

（4）肺部细菌含量计数

感染Newman小鼠，1D, 3D, 7D三个时间点，每组取两只小鼠，处死后，无菌条件下取左肺匀浆研磨后，倍比稀释1:10 四次，取0.1 ml稀释液加入MSA无菌平板，37℃恒温箱中过夜培养48h后，菌落计数，计算肺部细菌含量。

（5）流式细胞术检测

感染Newman小鼠，3D,每组取两只小鼠，无菌条件下采样，消化后细胞染色。

D3或D4天淋巴结Vβ3/CD3 Vβ8/CD3

D3或D4天肺组织F4/80+(巨噬细胞)CD3+（T细胞） CD11b+/Ly6G+（中性粒细胞） CD19+（B细胞）

（6）定量PCR检测 感染Newman小鼠，D1天采样,每组取两只小鼠，无菌条件下取肺组织和血液，trizonal 保存， -80度备用。检测指标血细胞 IFNy, IL-12p70, IP-10; 肺组织指标IFNy, IL-12p40,IL-6，TNFa, MIP-2, MCP-1.

（7）QPCR检测 D1、D3、D7天肺组织IFNy HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DRA表达水平

（8）Western blot检测 D3天或D4天脾脏和肺脏HLA-DPA1或 HLA-DPB1、HLA-DRA表达水平是否存在差异，上调还是下调？（细菌感染病理状态下HLA-DP、DR分子表达水平是否存在调控）

（9）细胞因子检测 感染Newman小鼠，24h采样,每组取两只小鼠，无菌条件下取肺组织和血液，分离血清及肺组织上清液，-80度备用。检测指标血细胞 IFNy, IL-12p70, IP-10; 肺组织指标IFNy, IL-12p40, IL-6，TNFa, MIP-2, MCP-1.

PVM为低于人间传染病名录三级安全风险的病原，人类感染的风险低，但不排除对免疫功能缺陷者的致病性。

PVM是啮齿类实验动物必须排除的病原体，对动物有致病性。会干扰其他实验研究。

鉴于此，此感染实验必须在BSL-2级以上的生物安全实验室进行病原学实验，在ABSL-2实验室进行动物实验。

HLA-DP4基因型分布在20-60%的世界人群中。HLA基因的不同表达对免疫应答反应进行调控。HLA-DPA1/DPB1基因表达调控方式存在差异，HLA-DP基因表达调控元件尚不清楚。将较完整HLA-DP基因组区域导入野生型小鼠体内，可获得接近HLA-DP生理水平表达的人源化转基因小鼠模型。因此筛选整合不同HLA-DP基因组区域的转基因小鼠，可在体内水平研究HLA-DP基因的表达调控机制。模型也可有效筛选能引起人HLA-DP4限制性免疫反应的物质。高水平表达人HLA-DPA1*0103/DPB1*0401(DP401)的转基因小鼠模型在筛选治疗传染性疾病和肿瘤的多肽疫苗中也有重要的应用。

人MHCII类分子可呈递金葡菌抗原，活化T细胞，升高细胞因子表达水平IFNY，诱发“细胞因子风暴”，金葡菌感染引起中性粒细胞在肺部的聚集，金葡菌释放毒素可对抗中性粒细胞的杀伤，因此中性粒细胞又成金葡菌的“庇护所”，而对肺部造成更大的病理损伤。已有报道显示C57BL/6 DR4tg 人源化小鼠对金葡菌抗原更易感，但HLA-DP分子在金葡菌感染过程中发挥的作用还未清楚。本研究期望通过和野生型及HLA-DRA人源化小鼠相比，研究HLA-DP人源化小鼠对金葡菌感染敏感性是否有变化，且从T细胞活化水平、细胞因子表达水平、免疫细胞群变化程度、肺部组织病理变化等方面，综合评价HLA-DP分子在金葡菌抗原呈递过程中的作用及可能的机制分析。