Alb-cre/DTR/SCOD-beige肝脏损伤小鼠模型

一、疾病概述

在Alb-cre/DTR/SCID-beige三转基因小鼠上使用白喉毒素可以产生可诱导性的肝脏损伤，建立肝脏损伤模型。通过移植人肝细胞可以获得人肝嵌合小鼠模型，该小鼠嵌合了人源的肝脏组织，可以用于肝脏相关疾病的研究。

二、模型背景

1、Alb-cre，DTR（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

Alb-cre，DTR基因

2、实验动物背景信息

Alb-cre:肝脏特异性表达Cre酶

DTR:条件性转入人白喉毒素受体基因，其表达受Cre/LoxP系统控制）的肝脏组织可特异性表达白喉毒素受体，当腹腔注射白喉毒素后，可特异性的诱导小鼠肝脏组织的损伤而不累及其他组织器官

SCID-beige:免疫缺陷小鼠

3、研究背景

肝脏疾病是对人类威胁最大的疾病之一，除病毒性肝炎外，肝脏疾病中肝硬化、肝癌等的危害也相当严重。约4亿人存在乙型肝炎病毒（HepatitisB virus，HBV）的慢性感染，且超过1/3的人群在中国，但目前仍未完全阐明其相关发病机制，也缺乏有效的治疗手段，成为危害人类生命和健康的重大公共卫生问题[1]。然而，人类肝脏重大疾病的研究迄今还比较缺乏合适的小动物模型作为支撑，在很大程度上限制了相关的转化医学研究。因此，建立生物学背景清晰，可模拟人类肝病过程，又易于获取的经济适用的小动物模型成为人类肝脏疾病研究发展的关键之一。

本项目拟开发基于白喉毒素的可诱导型肝损伤的免疫缺陷小鼠，通过移植人肝细胞及人免疫细胞，建立人肝/免疫系统双嵌合体小鼠模型，并以肝炎病毒感染该小鼠进行病毒学指标检测以及目前为止在相关模型上很少进行的免疫学研究，所开发的模型不仅可用于HBV、丙型肝炎病毒（HepatitisC virus，HCV）等重大传染性肝病的相关研究，而且可为脂肪肝、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的研究提供人源化研究平台。以下将以我国重大传染性疾病乙型肝炎病毒的感染研究为切入点，对项目拟开发的人肝/免疫双嵌合小鼠模型的研究背景、科学价值和创新意义进行分析。

1.1. 用于HBV感染研究的实验动物模型

动物模型是研究感染性疾病致病机理和筛选药物、研发疫苗的必需工具。目前针对HBV研究虽已建立了一些动物感染模型，但现有的HBV感染动物模型均存在一定的局限性。例如黑猩猩[2]为濒危动物，不仅价格昂贵，而且美国国立卫生研究院在2013年还因涉及伦理学问题限制了使用；猕猴可通过肝内注射HBV DNA载体成功感染HBV[3]，但研究成本相对较高，实验操作较为困难；树鼩[4]尽管可感染HBV，但由于感染的瞬时性导致HBV不能持续复制造成慢性感染；利用其它嗜肝病毒如鸭乙肝病毒[5]建立的感染模型也存在基因转录调控机制不同，禽类与人免疫系统差距较大等问题。因此，建立能有效模拟人体HBV感染及免疫应答的小鼠模型（例如人源化小鼠模型）成为深入推进HBV研究的重大而紧迫的需求[6]。

1.2 用于HBV感染研究的小鼠模型

现有HBV小鼠模型如转基因小鼠模型、急/慢性HBV转染小鼠模型、HBV感染人肝嵌合体小鼠模型等具有各自的特征[7-8]，在一定程度上促进了HBV的相关研究。但是这些小鼠模型在免疫致病、疫苗评价和药物筛选等方面存在HBV复制水平低、自身免疫耐受、种属差异或者缺乏免疫系统等需要克服的问题。

（1）转基因小鼠模型：理想的HBV转基因小鼠模型应是能够表达人HBV受体的转基因小鼠，这样就可以在一定程度上模拟HBV感染人肝细胞时的一系列过程。然而，对于介导HBV进入肝细胞的受体，最近有报道称NTCP(sodium taurocholate cotransporting polypeptide)是人HBV的功能性受体之一[9]，但小鼠的NTCP中却没有发现病毒入侵所需的分子决定基[10]。所以，具有HBV受体的转基因小鼠模型的建立仍然需要深入的研究。尽管HBV不能自然感染小鼠，但通过不同技术方法，我们还是建立了许多不同的转基因小鼠模型用于HBV的相关研究。

目前已有的HBV转基因小鼠模型均是基因整合模型，HBV的复制和基因编码产物在出生前已持续稳定表达，造成出生后小鼠对病毒抗原的免疫耐受，不能产生免疫应答。非复制型HBV转基因小鼠模型是将所选用的HBV各基因片段连接在HBV调节序列或外源性启动子等下游，显微注射后建立的HBsAg、HBxAg转基因小鼠等，但该小鼠不适于病毒复制等研究。复制型HBV转基因小鼠模型建立于1995年，Luca G.Guidotti等通过将大于HBV基因组全长的HBV DNA片段导入小鼠受精卵建立而成,在转基因小鼠体内能产生与病人血清中HBV相似的病毒颗粒[11]。国内多家单位也相继制备出D型、C型等HBV1.3转基因小鼠，应用于HBV药物的评价研究。HBV转基因小鼠模型在HBV相关疾病发病机制、抗病毒药物疗效等方面具有重要的应用价值，但是小鼠体内HBV均持续表达并维持一定水平，缺乏HBV复制和表达的动态变化过程，而且由于出生小鼠即对HBV免疫耐受，因而不能产生有效的免疫应答，在疫苗评价、免疫治疗等方面的应用受到一定局限。

（2）高压水动力法（Hydrodynamics-basedtransfection）转染模型：高压水动力注射法是在较短的时间内（5-8s），将大量（体重的8-10%）含目的DNA的生理盐水通过尾静脉注射入小鼠体内[12]，是一种对小鼠负荷较重但能使得注射DNA特异性转移到肝的较好方法。用此种方法注射HBV1.3裸质粒到免疫系统健全的小鼠中能引起HBV在肝脏的复制，同时病毒抗原和复制中间物可引起急性、自限性反应。HBV抗体和HBV特异性T细胞分别在注射后7天和15天产生[13]，且病毒很快被清除。

陈培哲团队通过高压水动力注射HBV1.2质粒到C57BL/6小鼠体内，成功建立了慢性转染模型[14]。他们又用8种不同品系小鼠造模，发现在不同品系小鼠中，HBV清除率不同，表明宿主的基因组成在一定程度上会影响HBV的感染结果[15]。本团队的实验结果也验证了以上结论：用高压水动力法注射HBV质粒到C3H/HeN 小鼠中，接近90％的注射小鼠HBV持续感染达46周[16]。所以应根据不同实验目的选用不同品系小鼠，这种基于高压水动力的HBV转染模型为体内研究HBV持续感染提供了可能。

值得注意的是高压水动力转染模型由于短时间内将大剂量基因组打入小鼠体内，会造成小鼠肝脏或其它组织物理损伤，可能产生非特异性影响。

（3）人肝嵌合体小鼠模型：在以上小鼠模型中，HBV不能通过真正的感染进入小鼠肝细胞，也就不能反映HBV的自然感染状态。所以为了更好的模拟HBV的自然感染，研究者尝试建立HBV感染的人肝嵌合体小鼠模型，该小鼠模型是采用免疫缺陷小鼠建立的感染模型，利用转基因或者基因敲除造成内源性肝细胞损伤死亡，从而有利于移植外源人肝而形成嵌合体小鼠。由于嵌入了人肝细胞，该模型可以模拟人类自然感染HBV的过程；但为了避免人肝细胞移植引起的免疫排斥，该类模型往往需要利用免疫缺陷小鼠。

uPA/SCID是目前公认已广泛应用的肝移植小鼠模型，1990年，DrBrinster’s团队研究出了该转基因小鼠，其原理是在严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠上通过转基因的方式引入带有白蛋白（Albumin）启动子的尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因，导致该小鼠肝脏特异性表达uPA，转基因的表达诱导了渐进性肝功能衰竭[17]。uPA杂合子对肝脏的损伤已很严重，纯合子新生鼠肝脏的损伤更严重, 造成很高的死亡率[18]，需要移植外源肝脏恢复肝功能后小鼠才可存活下来，因此外源人肝细胞的嵌合重建率最高能达到99%。uPA/SCID人肝嵌合小鼠可用于肝炎病毒的体内感染复制研究、抗病毒药物筛选等。然而该模型也存在一定的缺陷：Alb-uPA小鼠的某些肝细胞可能通过重组机制清除uPA转基因，并快速增殖，直到8～12周恢复整个肝脏，对移植肝细胞增殖能力造成很大的限制[19]。因此，移植手术一般要在出生后最初两周内完成，以提高移植人肝细胞的嵌合成功率。但小鼠过幼给手术增加了很大的难度，加上SCID的免疫缺陷背景，导致小鼠死亡率较高，有很大的局限性。持续的upa诱导的肝毒性使这种模型不太适合长期毒理学研究。同时，SCID突变只会影响适应性免疫系统，这些小鼠需要抗血清来中和自然杀伤细胞和/或反补使移植的人体细胞得以存活。

2007年第二种嵌合小鼠模型Rag2-/-Il2rg-/-Fah-/-（FRG）小鼠模型诞生了，该小鼠模型敲除了延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetatehydrolase，FAH)。这个酶的缺失会导致酪氨酸代谢障碍，使得延胡索酰乙酰乙酸会大量累积[20]，从而导致肝脏受损。该模型与uPA/SCID小鼠模型的区别在于其肝脏损伤的时间和程度可以通过一个2-(2-硝基-4-三氟苯甲酰)-1，3环己二酮（NTBC）的药物选择系统进行人为控制，但是该模型的小鼠会发展为肝细胞癌，也就是人们所熟知的I型酪氨酸血症。因此，需要给予药物或者控制饮食，以预防肝脏肿瘤的发生。

随后日本研究者建立了一种新型的人肝嵌合小鼠模型，利用自杀基因系统I型单纯疱疹病毒（HerpesSimplex Virus-type I，HSV-I）的胸腺嘧啶激酶（ThymidineKinase，TK)系统获得了TK-NOG小鼠模型[21]。该胸腺嘧啶激酶被肝脏特异性的Alb启动子控制，与无毒的环氧鸟苷（Gancyclovir，GCV）这种物质一起构成HSV-tk/GCV表达系统。通过胸苷激酶的表达，将无毒的药物前体磷酸化为强毒性代谢物三磷酸丙氧鸟苷，其作为DNA和RNA 链的终止剂将小鼠自身的肝脏细胞杀死，而不需要注射外用药物去实现。与(NOD)-SCID基因缺陷小鼠[22]杂交成为TK-NOG小鼠，该小鼠同时缺陷天然免疫（Il2rg-/-）和适应性免疫（SCID）反应。移植到该小鼠体内的人肝细胞可以正常地发挥功能达8个月之久。该模型克服了以上两个模型的缺陷，也成功地被用于药物代谢的遗传多样性研究上[23]。其优点在于肝脏的损伤是在一个可控且有限的时间内快速产生；天然免疫反应和适应性免疫反应同时缺失；不需要外加药物维持小鼠生存。

2015年 日本学者建立了Alb-TRECK/SCID[24]小鼠模型。虽然该模型也是基于白喉毒素受体诱导系统的小鼠，但是通过移植人胎肝细胞和肝脏干细胞建立人源肝嵌合小鼠，同时该模型只进行了肝脏细胞移植后利用该人肝嵌合小鼠进行药物代谢方面的研究，并没有进行免疫系统嵌合获得人肝/免疫双嵌合小鼠用于病毒感染后的相关免疫学研究。且SCID突变只会导致T细胞、B细胞缺陷，NK细胞功能基本正常，作为后续人肝嵌合及免疫嵌合的宿主不太理想。

国内北京大学邓宏魁研究组2009年在Am JPathol报道了利用tet-on调控系统以及腺病毒感染转入uPA基因的方法来实现uPA可调控表达和定时肝损的发生[25]。然而，由于维持uPA表达需反复进行腺病毒感染，宿主小鼠可产生针对腺病毒的抗体，因而影响后面腺病毒感染率从而降低uPA表达；而且该模型只适合肝移植和再生的研究，并不适合用于HBV等的感染研究，因为腺病毒感染本身可激活天然免疫从而影响到后续HBV的感染。

以上诸多模型由于嵌合鼠缺乏免疫系统，不能用于HBV感染的免疫病理和相应的肝脏病变研究，也不能应用于候选疫苗筛选评价等免疫相关研究。实际上，对于临床候选疫苗和药物的筛选评价，即便使用免疫健全的小鼠，由于人与鼠的种属差异，在普通小鼠中进行的免疫效果评价尤其是细胞免疫效果也无法反映人体免疫特征，导致大量的候选疫苗和药物在常规HBV动物模型上的评价结果与临床结果不一致，大多无法应用于临床。因此，开发人肝及人免疫系统双嵌合的小鼠模型（可以模拟HBV感染人类肝脏的自然过程、同时具有人体免疫应答特征）对于HBV研究具有重大意义。

（4）可诱导型肝损基础上的人肝/免疫双嵌合小鼠模型：鉴于以上原因，国际上病毒性肝炎著名学者Charles M.Rice和Alexander Ploss 2010年在J Clin Invest 上发表评论，认为可诱导型肝损上基础上的人肝/免疫双嵌合小鼠模型将可能成为人类肝脏病研究领域中新的地平线[26]。

2011年美国北卡卡罗来纳大学Su Lishan为首的团队在Gastroenterology杂志发表论文，报道了在 FKB-Caspase 8调控的可诱导型肝损基础上，在BALB/cRag2-/-C-null的免疫缺陷鼠背景下，利用人胚胎肝细胞和造血肝细胞移植构建了人肝及人免疫系统双嵌合的小鼠模型，并运用于HCV的感染研究[27]。然而数据显示，该模型的外源人肝细胞在小鼠肝脏的重建率仅为30％左右，仍远不及uPA/SCID模型的重建率，因此与人体内HBV感染的实际过程的模拟度还有较大的空间需要提高。

2014年，Su Lishan又和Bility共同发表了A2/NSG-HuHSC/Hep小鼠模型，基于该模型进行了HBV感染后，75%的小鼠可以发展为长达4个月的长期感染状态，发现与高水平的M2样巨噬细胞有关[28]。

2017年，法国学者 Dusséaux M在 BALB/c/Rag2-/-/IL-2rg-/-/Sirpa-/-/Alb-uPA小鼠上进行人肝嵌合或者人肝/免疫双嵌合后比较HBV感染后的病毒学相关指标，并进行了恩替卡韦药物疗效的探究[29]。该模型也尚未实现商业化。

我国在肝脏人源化动物模型技术方面与发达国家仍存在一定的差距，而这些国家在关键动物模型及相关技术方面，即便同意可将某些模型给我国学者进行基础科学研究，也往往限制其用于药物开发筛选等技术服务工作。鉴于当前HBV肝炎病毒及相关重大肝脏疾病在我国的严重性，缺乏自主知识产权的可用于病毒性肝炎基础及防治药物研究的人源化动物模型，或成为限制我国推进相关病毒性肝炎等重大疾病研究的技术瓶颈。

2019年初，厦门大学的夏宁邵教授团队和浙江大学附属第一医院李君教授团队共同在在Gut上发表了他们的研究成果，基于anti-CD95的方式诱导急性肝衰竭的FRGS小鼠模型，在该模型上通过人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的移植建立了人肝及人免疫双嵌合小鼠模型，获得了自然感染HBV病毒染诱发的肝硬化小鼠模型，并进行了模型的各个方面的综合评估[30]。该模型非常成功的建立了HBV自然感染诱发的肝硬化小鼠模型。但该研究仍是基于在国外FRG模型核心技术基础上的工作。

本项目拟建立人肝及人免疫系统双嵌合的（Alb-cre/DTR/SCID-beige，ADSB）小鼠模型，该模型的原理在于Alb-cre/DTR（Alb-cre：肝脏特异性表达Cre酶；DTR：条件性转入人白喉毒素受体基因，其表达受Cre/LoxP系统控制）小鼠的肝脏组织可特异性表达白喉毒素受体，当腹腔注射白喉毒素后，可特异性的诱导小鼠肝脏组织的损伤而不累及其他组织器官。Alb-cre/DTR小鼠与免疫缺陷小鼠SCID-beige杂交后，在诱导性肝脏损伤与免疫缺陷的基础上可引入人肝细胞与人免疫细胞（成人肝脏细胞比人胎肝细胞和肝脏干细胞更易于获得），从而构建人肝/人免疫系统双嵌合小鼠模型。该模型可以克服原有许多模型无法实现可诱导性的肝脏损伤，从而提供更长的手术窗口期，降低手术难度；同时预计可以解决某些模型肝脏重建率较低的局限。综上所述，该ADSB小鼠人肝嵌合模型基于白喉毒素诱导性肝脏损伤，同时嵌合人免疫细胞，再以HBV感染模型为例研究该模型的生物学特性和进行免疫学相关分析，是以往相关模型的补充和延伸。该模型技术的建立不仅将为肝移植研究提供一种可行的动物模型支撑，同时会为HBV、HCV等肝炎病毒感染小动物模型的研究提供新的研究方向，预计可以成为国内自主研发的具有较高移植效率的可进行肝炎病毒免疫学研究的人源化小鼠模型。

参考文献：

[1] Guidotti LG, Chisari FV. Immunobiology andpathogenesis of viral hepatitis [J]. Annu Rev Pathol, 2006, 1: 23-61.

[2] Wieland SF. The chimpanzee model forhepatitis B virus infection [J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015;5, pii:a021469.

[3] Gheit T,Sekkat S,Cova L, et al. Experimentaltransfection of Macaca sylvanus with cloned human hepatitis B virus [J]. J GenVirol, 2002;83:1645–1649.

[4] Baumert TF, Yang C, Schürmann P, et al.Hepatitis B virus mutations associated with fulminant hepatitis induceapoptosis in primary Tupaia hepatocytes [J]. Hepatology, 2005, 41(2): 247-256.

[5] Lin E, Luscombe C, Colledge D, et al.Long-term therapy with the guanine nucleoside analog penciclovir controlschronic duck hepatitis B virus infection in vivo [J]. Antimicrob AgentsChemother, 1998, 42(8): 2132-2137.

[6] Dandri M,Lutgehetmann M,Volz T, et al. Small Animal ModelSystems for Studying Hepatitis B Virus Replication and Pathogenesis [J]. Semin Liver Dis, 2006, 26(2):181-191.

[7] Kimura K,Kakimi K,Wieland S,et al. Interleukin-18inhibits hepatitis B virus replication in the livers of transgenic mice [J]. JVirol, 2002, 76(21): 10702-10707.

[8] Robek MD,Boyd BS,Wieland SF,et al. Signal transduction pathwaysthat inhibit hepatitis B virus replication [J]. Proc Natl Acad Sci, 2004,101(6): 1743-1747.

[9] Yan H,Zhong G,Xu G,et al. Sodium taurocholatecotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and Dvirus [J]. ELife, 2012, 1: e00049.

[10] Yan H,PengB,He W,et al. Moleculardeterminants of hepatitis B and D virus entry restriction in mouse sodiumtaurocholate cotransporting polypeptide [J]. J Virol,2013, 87(14): 7977-7991.

[11] Guidotti LG,Matzke B,Schaller H,et al. High-Level Hepatitis B VirusReplication in Transgenic Mice [J]. J Virol,1995, 69(10): 6158-6169.

[12] Liu, F, Song, Y, Liu, D. Hydrodynamics-basedtransfection in animals by systemic administration of plasmid DNA [J]. GeneTher, 1999, 6(7): 1258-1266.

[13] Yang PL,Althage A,Chung J,et al. Hydrodynamic injection of viralDNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection [J]. Proc Natl Acad Sci,2002, 99(21):13825-13830.

[14] Huang LR,Wu HL,Chen PJ,et al. An immunocompetent mouse modelfor the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection [J]. Proc NatlAcad Sci,2006, 103(47): 17862-17867.

[15] Chou HH,Chien WH,Wu LL,et al. Age-related immuneclearance of hepatitis B virus infection requires the establishment of gutmicrobiota [J]. Proc Natl Acad Sci,2015, 112(7):2175-2180..

[16] Peng XH,Ren XN,Chen LX,et al. High persistencerate of hepatitis B virus in a hydrodynamic injection-based transfection modelin C3H/HeN mice [J]. WJG, 2015, 21(12): 3527-3536.

[17] Meuleman P,Libbrecht L,De Vos R,et al. Morphologicaland biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera[J]. Hepatology, 2005, 41(4):847-856.

[18] Heckel JL,Sandgren EP,Degen JL,et al. Neo- natalbleeding in transgenic mice expressing urokinase-type plasminogen activator[J]. Cell, 1990, 62(3):447– 456.

[19] Grompe M. Complete hepaticregeneration after somatic deletion of an albumin-plasminogen activatortransgene [J]. J Hepatol, 2002, 37(4):422-424.

[20] Azuma H,Paulk N,Ranade A, et al. RobustexpansionofhumanhepatocytesinFah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- mice[J]. NatBiotechnol, 2007, 25(8):903–910.

[21] Hasegawa M, Kawai K, Mitsui T, et al. Thereconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional [J].Biochem Biophys Res Commun. 2011, 405(3): 405-410.

[22] Ito M, HiramatsuH, Kobayashi K, et al.NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model forengraftment of human cells [J]. Blood. 2002, 100(9): 3175-3182.

[23] Hu Y, Wu M, Nishimura T, et al. Humanpharmacogenetic analysis in chimeric mice with ‘humanized livers’[J]. Pharmacogenet Genomics, 2013, 23(2): 78-83.

[24] Zhang, R.R, Zheng YM, Bin Li，et al.Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failureAlb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolismcapabilities. . Stem Cell Research & Therapy , 2015, 6:49.

[25] Song X,Guo Y,Duo S,et al. A mouse model ofinducible liver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies ofhepatocyte transplantation [J]. Am J Pathol, 2009, 175(5):1975-1983.

[26] de Jong YP,Rice CM,Ploss A. New horizons for studyinghuman hepatotropic infections [J]. J ClinInvest, 2010,120 (3):650-653.

[27] Washburn ML,Bility MT,Zhang L,et al. A humanizedmouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liverdisease [J]. Gastroenterology, 2011,140(4):1334-1344.

[28] Bility MT, Cheng L, Zhang Z,etal.HepatitisBvirus infection and immunopathogenesis in ahumanized mouse model:induction of human-specific liver fibrosis and M2-likemacrophages[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(3):e1004032.

[29] Dusséaux M, Masse-Ranson G,Darche S, et al. Viral load affectsthe immune response to HBV in mice with humanized immune system and liver. Gastroenterology, 2017,153(6):1647-1661.

[30] Yuan L, Jiang J, Liu X, et al.HBVinfection-induced liver cirrhosis development in dual-humanised mice with humanbone mesenchymal stem cell transplantation. Gut, 2019,0:1-13.

1.ADSB三转基因小鼠的育成

由上海斯莱克实验动物中心购买SCID-beige小鼠，按照动物饲养标准在上海市公共卫生临床中心实验动物中心用无菌隔离器进行常规保种并繁殖扩群后，与Alb-cre/DTR小鼠以同居的方式进行繁殖，产生F1代杂交小鼠离乳后标记，剪鼠尾进行基因型检测。Alb-cre纯合子在279bp处有条带，DTR纯合小鼠在使用DTR/EGFP引物对扩增后在234bp处有条带，SCID纯合小鼠在38bp和26bp处均有条带，采抗凝血后通过流式细胞仪检测该小鼠T细胞、B细胞均缺失，NK细胞部分缺失。

2.诱导型ADSB小鼠模型的建立

取ADSB小鼠和C57BL/6对照小鼠（购自上海斯莱克实验动物中心），于实验前采血，分离血清，检测造模前小鼠本底ALT与AST值。之后称取体重，将不同剂量的白喉毒素（10ng/g，5ng/g，2.5ng/g，1.2ng/g，0.6ng/g，0.3ng/g小鼠体重）溶于200 µl的PBS溶液中，通过腹腔注射的方式造模，分别于造模后不同时间点监测小鼠体重并采血分离血清检测ALT与AST值，已经确定1.5ng/g的白喉毒素使用剂量既不影响小鼠生存又可产生特异性肝脏损伤。

3.人肝细胞移植

在注射白喉毒素后第1-3天，每天采集小鼠外周血，分离血清，检测ALT值是否升高，升高则确定为肝损造模成功。将ADSB小鼠由无菌隔离器转移至生物安全柜中，麻醉，消毒手术器械对小鼠进行脾内注射手术，1×107个成人肝细胞（购买自瑞德肝脏疾病研究有限公司）用1ml生理盐水重悬后，使用胰岛素注射器抽取100 µl注射入小鼠脾脏内，后进行手术缝合，置于保温台直至苏醒后再转移至无菌隔离器，单笼饲养，手术后给予三天青霉素腹腔注射防止感染。人肝细胞移植后的2周，4周，8周，12周分别采集小鼠的外周血，分离血清，人白蛋白（Albumin）ELISA试剂盒检测血清中人Albumin的表达情况，以未移植的C57BL/6小鼠作为阴性对照，正常人血清作为阳性对照。

1. ADSB小鼠的育成

目前上海市公共卫生临床中心实验动物中心已从美国JacksonLab引进Alb-cre小鼠，从北京百奥赛图引进DTR小鼠，从上海斯莱克有限公司引进SCID-beige小鼠，并常规保种。通过三品系小鼠杂交获得了Alb-cre/DTR/SCID-beige小鼠，繁育流程见图1A。PCR检测显示含有Alb-cre基因的小鼠在279bp有条带，DTR基因纯合子只在234bp处有条带，杂合子在469bp和234bp处均有条带（图1B）。

图1 Alb-cre与DTR基因型鉴定结果

2.肝脏损伤模型的建立及肝损伤指标的检测

取隔离包饲养的ADSB小鼠，使用白喉毒素通过腹腔注射的方式造模，部分小鼠与造模后第三天处死取肝脏组织进行大体观察及HE染色。结果显示在注射白喉毒素第三天后ADSB小鼠的肝脏组织较明显变白，损伤非常显著（图2 A 、B）。进一步通过HE染色观察，C57BL/6小鼠肝脏组织结构正常，肝小叶完整，肝细胞索与肝血都排列规则，未见肝细胞异常；而ADSB小鼠肝细胞核碎裂，出现核溶解消失等病理现象，表现出严重的肝细胞坏死（图2 C、D）。

图2 肝脏大体观察与HE染色

注：A、 C 为C57BL/6小鼠 ；B、D为ADSB小鼠

3. 肝脏损伤模型的建立及肝损伤指标的检测

取隔离包饲养的ADSB小鼠，通过腹腔注射的方式造模，每天对小鼠的体重进行持续观测，并采血分离血清检测ALT值。结果显示在注射白喉毒素后ADSB小鼠的体重出现了显著的降低，而C57BL/6的体重没有显著的变化（图3 A）；ADSB小鼠的ALT值出现了显著的上升，随后又逐渐下降，而C57BL/6的ALT值与注射白喉毒素之前相比没有显著的变化(图3 B)。

图3 体重曲线及ALT检测数据

注：A、体重曲线 B、ALT曲线

（空心圆代表C57BL/6小鼠；实心圆代表ADSB小鼠）

（*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001）

4. 人肝嵌合模型建立及人白蛋白指标检测

取隔离包饲养的ADSB小鼠，通过腹腔注射的方式造模后的第三天进行人肝细胞移植，脾内注射1×106细胞，移植后的7,14,21,28天取血进行人白蛋白ELISA检测，流程见图4A，结果显示ADSB小鼠在移植后的第28天人白蛋白表达显著，而C57BL/6小鼠无白蛋白表达，说明人肝嵌合模型建立（见图4B）。

图4 人肝嵌合模型建立流程图及人白蛋白ELISA检测

（**代表P<0.01）

小鼠制作过程没有对环境和生态没有产生影响。

旨在建立可基于白喉毒素受体系统的可用于HBV、HCV等病毒性肝炎免疫学研究的可诱导型肝脏损伤的人肝及免疫系统双嵌合体小鼠模型并对模型进行综合评价。

通过白喉毒素诱导表达系统构建的新型的可诱导型人肝及人免疫系统双嵌合小鼠模型，以弥补之前模型未嵌合免疫系统无法进行病毒与宿主免疫学研究的缺陷。

本项目首次在基于白喉毒素诱导性肝脏损伤的ADSB小鼠人肝嵌合模型基础上，同时嵌合人免疫细胞，开发人源化肝、免疫系统双嵌合的小鼠模型，并在此基础上以HBV感染模型为例研究该模型的生物学特性和免疫学特性。HBV感染上述小鼠后所建立的模型可解决以往HBV感染人源化小鼠模型无免疫系统的缺陷，能更好模拟病毒自然感染致病和免疫应答过程，将是研究感染、免疫和致病机制的有力工具，并可能作为HBV新疫苗的筛选平台。所开发的人肝/免疫系统的双嵌合体小鼠不仅可用于HBV、HCV感染等重大传染性肝病的研究，而且可为脂肪肝、肝硬化、肝癌等重大肝脏疾病的研究提供人源化研究平台。