AAV注射诱导恒河猴亨廷顿病模型

一、疾病名称

亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）

二、HD简介

临床症状主要表现为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆，称为“三联征”。

病理表现主要为基底节区萎缩，其中以尾状核最为明显，壳核和苍白球也有不同程度的萎缩。神经元缺失主要见于基底节区和皮质。

发病机制是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病。患者第四号染色体上的Huntington基因发生变异，产生了变异的mHTT，在细胞内逐渐聚集，形成大的分子团，在脑中积聚，影响神经细胞的功能。

三、亨廷顿蛋白与HD

huntington基因处在第4号染色体的上部，亨廷顿病是由于huntington基因第1外显子内部不稳定的CAG三核苷酸重复序列异常扩展而发病，属于三联体重复序列疾病。等位基因CAG的重复数在正常人多在26次以下，HD患者则多超过40.5次，平均46.42次，可高达100次。

huntington蛋白在全身各个器官包括中枢神经系统广泛表达，其正常功能尚未完全明确，可能与神经系统发育、细胞内吞和分泌及抑制细胞凋亡有关。亨廷顿病患者huntington基因的重复CAG序列可产生一段多聚谷氨酰胺链（polyglutamine，polyQ），连于HTT的末端，使HTT与其他蛋白结合形成不溶性复合物（核内包涵体形成），并与其他蛋白相互作用，使神经元内蛋白错误折叠，影响蛋白的进展和降解过程，产生毒性功能。

构建腺相关病毒（AAV2/6），表达具有103个CAG重复序列的mHTT，并带有绿色荧光标记。将过表达变异亨廷顿蛋白的腺相关病毒通过脑立体定位注射的方法注射到恒河猴（5-6周岁，体重5-7公斤）双侧纹状体内，从而建立亨廷顿病的恒河猴模型。每只动物注射AAV剂量为200μl，2.65×1013IU。

1、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴脑部病理表型

亨廷顿蛋白免疫荧光染色：

为了观察注射入纹状体的HD患者脑提取物在动物脑内的分布情况以及对神经细胞的影响，在立体定位注射手术后30周，注射部位免疫荧光染色的结果如图1 A-H所示，（A-D）注射AAV-Exon1-103Q-GFP的模型组动物，在MAP2阳性细胞的胞质中有GFP和mHTT阳性聚集物的染色。（E-H）注射AAV-Exon1-19Q-GFP的对照组动物细胞质中出现弥漫性的GFP和mHTT阳性染色。（I）模型组和对照组纹状体神经元数量未观察到明显改变。（J）模型组纹状体星形胶质细胞数量增加。（K）与对照组相比，模型组细胞内外的mHTT聚集物数量更多。（L）对照组和模型组动物内源性HTT蛋白水平无明显差异。

立体定位注射手术后30周，免疫荧光染色检测注射部位mHTT的分布情况（A-H）。注射部位神经细胞密度和mHTT的分布水平（I-L）。

2、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴行为学表现

Viewpoint视频监测系统检测动物运动量

在脑立体定位注射HD患者脑提取物手术后，通过Viewpoint视频系统对动物进行运动量检测，结果如图2所示，与对照组动物相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP动物的总运动距离无明显差异，（B）动作剧烈程度的分布无显著差异，静止、中等强度和剧烈活动的比例无明显差异。对照组和模型组动物的活动量无明显差异。

取物试验（Object retrieval task）

在脑立体定位注射AAV-Exon1-103Q-GFP手术后，通过取物试验检测模型组和对照组动物的运动和认知功能水平。结果如图3所示，与对照组相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP后，模型组动物在取物训练过程中出现的运动错误数量无明显差异，（B）模型组动物取物训练过程中出现的认知错误无明显差异，（C）各组动物一次尝试即正确完成的成功率无明显差异。结果反映，模型组与对照组在上肢运动和认知功能上无明显差异。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。