嗅球切除大鼠抑郁症模型

抑郁症是一种严重影响人体健康的精神疾病，其患病率约占总人口的3%。世界卫生组织预测到2020年抑郁症将成为第二大主要疾病之一，给社会带来极大经济负担，抑郁症已成为全世界共同面临的卫生健康难题。近年来研究发现，应激性生活事件是抑郁症的显著促发因素，引发抑郁的主要原因是来自慢性、低强度、长期的日常压力。

目前，抑郁症尤其是中重度抑郁症的主要治疗手段仍是药物治疗。20多年以来，随着人们对抑郁症机制研究的深入，抗抑郁药物的研究开发也取得了极大进步。由于合成抗抑郁药大多存在抗抑郁谱窄、不良反应大、药价高和易复发等缺陷，人们逐渐把目光投向传统的中医药。传统药物和天然药物作为抗抑郁候选药物的研究开发已日渐成为国内外的热点。

大鼠嗅球切除模型属于脑损伤抑郁模型，模型动物的行为学表现和病理生理改变与抑郁症患者吻合，抗抑郁药物在该模型中敏感，且一般需要慢性给药才能发挥抗抑郁作用，与临床起效时程一致。大鼠嗅球切除模型是目前评价化合物是否具有抗抑郁作用的常用抑郁动物模型。

雄性大鼠，体重300-350g，SD大鼠应用最广泛。

1. 药品与试剂

水合氯醛（或其它麻醉药物如戊巴比妥钠）；无菌生理盐水（或PBS或双蒸水）；H2O2溶液；吸收性明胶海绵；青霉素钠粉；云南白药；乙醇。

2. 实验仪器 脑立体定位仪；电动磨钻；自制探针；真空水泵；手术器械。

3. 实验方法

在手术前1周内，每日对大鼠进行2次抚摸以减少应激。术前给予水合氯醛（400mg/kg，ip）麻醉大鼠，在两耳联线中点处将皮肤切开，暴露颅骨，在距前囟前8 mm，与正中缝两侧旁开2 mm的交点处，分别用电动磨钻将颅骨钻两个直径2 mm的小孔，用自制探针搅动破坏嗅球后，再用真空泵将破坏的嗅球组织吸出。将吸收性明胶海绵填入小孔止血。假手术大鼠采用相同的手术方法，但在手术定位点上钻孔后不损伤嗅球。术后采用75 %乙醇-云南白药混合剂涂抹伤口，并肌注青霉素钠（40000U/ml），连续注射4 d，以防术后感染。嗅球切除术后大鼠需恢复14 d，恢复阶段每日抚摸大鼠以减少应激性，14天后方可进行药物处理及行为学测试。行为学测试主要包括开场实验、蔗糖饮水实验、被动回避实验等。

图1 大鼠嗅球解剖位置示意图

4. 注意事项

（1）大鼠体重会影响嗅球解剖位置的定位坐标；

（2）术前、术后的抚触可有效减少大鼠的应激反应；

（3）手术过程中应尽量减少出血；

（4）行为学测试结束后，每只动物需检查嗅球和前额叶皮层位置，对于嗅球切除体积低于70%或损伤前额叶皮层的动物，数据应剔除。

图2 大鼠嗅球切除前后对比（A嗅球切除前；B嗅球切除后）

1. 开场实验

a) 总路程（total distance）：动物在实验记录时间内产生的物理位移累积。

b) 速度（speed）：动物在单位时间产生的物理位移。 5 min内正常动物总路程多为1000 cm -2500 cm，速度为3 cm/s -8 cm/s。动物出现抑郁行为时，速度减少。

c) 运动总时间（total move time）：动物在实验记录时间内的产生物理位移时所需的时间累积。正常动物运动时间多大于检测时间的30%；抑郁行为判断标准：与对照组相比有显著性减低（P <0.05）。

d) 站立次数（number ofstanding）：动物在实验记录时间内的站立总次数。10 min检测时间，正常组大鼠站立次数20次-50次。10 min检测时间，正常组小鼠站立次数60次-130次，抑郁行为判断标准：与对照组相比有显著性减低（P <0.05）。

图3 大鼠嗅球切除对动物开场实验的影响（sham 空白组；OBX 嗅球切除组；OXB+Flu 绣球切除+氟西汀）

2. 嗅球切除对动物强迫游泳实验的影响

评价指标应采用动物不动、攀爬、游泳三类动作的时间及次数进行判定。

a) 不动（immobility）：动物在水中停止挣扎，呈漂浮状态，仅有轻微的肢体运动以保持头部浮在水面。不动时间越长表明抑郁程度越重。正常小鼠不动时间在检测时间的40%-80%内；正常大鼠不动时间在检测时间的30%-70%内；抑郁行为判断标准：不动时间与对照组相比显著性增加（P <0.05）。

b) 游泳（swimming）：动物进行流畅、协调的运动，动物四肢始终在水面以下。游泳时间和游泳距离越少，表明抑郁程度越重。

c) 攀爬（climbing）：动物四肢强有力伸出水面，并沿测试箱壁做剧烈的上下动作。5 min检测期内,SD大鼠攀爬时间60s -130 s。攀爬时间越少，表明动物抑郁程度越重。

图4 大鼠嗅球切除对动物强迫游泳实验的影响（sham 空白组；OBX 嗅球切除组；OXB+Flu 绣球切除+氟西汀）

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。