Prp-hAPP/ hPS1双转基因痴呆症小鼠模型

一、疾病名称

阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）

二、疾病临床症状及致病机制

阿尔茨海默症（Alzheimerdisease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性变性疾病，其临床表现以退行性大脑认知，识别功能障碍为特征，有明显记忆力降低并伴随个性和行为的改变。AD约占全部痴呆病人的70%，位于心脏病、癌症和中风之后的第四位死亡性疾病，目前已成为发达国家主要社会问题之一。AD主要神经病理特征包括细胞外大量由β淀粉样蛋白（Aβ）组成的老年斑（SenilePlaques，SP）、神经细胞内神经原纤维丝缠结（NeurofibrillaryTangles，NFT）、神经细胞丢失，皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性及大脑皮质萎缩。

迄今为止，AD的发病机制尚未完全明确，主要有几种假说：β淀粉样蛋白学说、tau蛋白学说、基因突变学说、能量代谢障碍学说等等，其中Aβ、Tau、PS1和ApoE等作为主要的易感基因均在AD的发病过程中起到重要作用。其中Tau蛋白在AD患者脑中总量多于正常人：正常Tau蛋白减少而异常过度磷酸化Tau蛋白大量增加。Tau过度磷酸化后与微管蛋白的结合力下降90%，导致AD患者脑中受累神经元微管结构广泛破坏，正常轴突转运受损，引起突触丢失神经元功能损伤，发生脑神经退行性病变。由于近年来基于Aβ假设的治疗方案均被临床研究否决，且与老年斑相比，脑细胞内神经原纤维丝缠结程度与患者临床痴呆程度相关性更好，使得Tau基因的相关研究已经成为目前AD研究的焦点。

PrP-hApp/hPS1双转基因阿尔兹海默病小鼠模型。

品系名称为：C57BL/6J-TgN（APP/PS1）ZLFILAS

背景品系为：C57BL/6J

启动子为：Mouseprion protein（PrP）

靶基因信息：（突变点）Mo/HuAPP Swedish mutations（K595N/M596L）+HuPS1 deltaE9

构建信息：

利用PrP-hAPPK595N/M596L痴呆症模型小鼠和PrP-hPS1dE9痴呆症模型小鼠杂交培育而成。所得新生小鼠1周内剪鼠尾，提取基因组DNA，PCR鉴定APP/PS1转基因动物的基因表型鉴定，其中APP基因PCR产物长344Kb，PS1基因PCR产物长608Kb，保留阳性小鼠。

1、APP/PS1双转基因小鼠表型的鉴定（图1）。

图1 1、2号为转基因阴性小鼠，3、4、5、6、7、8号为APP/PS1双转基因阳性小鼠，9号为Marker。

2、病理学检验

免疫组织化学选用 Aβ1-17 抗体(1:200) ，改良的Bieschowsky 银染法、Thioflavin-S荧光结果均显示3月龄动物未检测到明显老年斑出现。4. 5月龄时APP/PS1双转基因阳性小鼠在大脑皮层出现老年斑，随着月龄增加，大脑皮层老年斑数量体积明显增加，9~12月龄小鼠大脑出现与阿尔茨海默病患者相似的老年斑。上述3种方法标记老年斑效果一致（图2）。

图2 A、3月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑海马区抗Aβ1-17免疫组化染色（100×）；B、4月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层抗Aβ1-17免疫组化染色（100×）；C、4.5月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层抗Aβ1-17免疫组化染色（200×）；D、6月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑海马区抗Aβ1-17免疫组化染色（100×）；E、9月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层抗Aβ1-17免疫组化染色（200×）；F、12月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层抗Aβ1-17免疫组化染色（200×）；G、3月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；H、4.5月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；I、6月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；J、9月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；K、12月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；L、APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层Thioflavin-S荧光标记结果（200×）；M、4.5月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层改良 Bielschowsky 银染结果（200×）箭头所指为老年斑；N、6月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层改良 Bielschowsky 银染结果（200×）；O、9月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层改良 Bielschowsky 银染结果（200×）；P、12月龄APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层改良 Bielschowsky 银染结果（200×）。

3、行为学结果

APP/PS1小鼠在3月龄出现认知和行为学变化，Morris水迷宫试验发现3、6、9月龄APP/PS1双转基因小鼠空间探索实验结果与同月龄野生型小鼠相比有显著差异，较同月龄野生型C57BL6J小鼠学习及记忆能力降低（P< 0. 05）（图3) 。

图3 Morris水迷宫第六天空间探索实验结果比较

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。