KM突变慢性炎症小鼠模型

慢性炎症性皮肤病常见的有银屑病、湿疹、神经性皮炎、斑秃、系统性红斑狼疮（SLE)等。发病原因很多，如：感染、环境、内分泌、代谢、免疫功能异常及遗传等。发病范围广，发病率高，仅银屑病的发病率就占世界人口的0.1%～3%，且反复发作，难以治愈，给患者带来极大的痛苦，严重影响生活质量，是医学上仍未解决的难题之一，越来越受到人们的关注。

目前对慢性炎症性皮肤病的研究多集中在基因工程小鼠模型，主要通过皮肤上皮细胞角蛋白启动子构建的转基因和基因敲除小鼠模型，这种模型通常仅基于单基因操作，而此类疾病被认为是多基因位点共同作用的结果，因此用这种小鼠模型来研究人类复杂炎症性皮肤病是有缺陷的。也有一些自发突变模型小鼠，如：斑秃模型小鼠C3H /HeJ，狼疮模型小鼠MRL/lpr、NZB/W.F1等，银屑病样表型的自发突变小鼠鳞状皮肤小鼠（Ttc7fsn / Ttc 7fsn)、慢性增生性皮炎突变小鼠（Sharpincpdm/ Sharpincpdm)、纯合皮质突变小鼠（Scd1ab /Scd1ab)等，其表型及病理改变各不相同，均只能反映人类炎症性皮肤病复杂的病理生理改变的一部分，且在应用过程中有一定的局限性。如斑秃模型小鼠外显率低，发病不稳定；狼疮模型小鼠来源困难，价格昂贵；银屑病模型小鼠在皮损浸润的炎细胞中缺乏T细胞，并且抗银屑病的药物治疗无效，因此它们也不是理想的动物模型。

发病机制复杂，研究表明此类疾病多为免疫细胞介导的自身免疫相关性疾病，包括细胞因子网络复杂的功能及生长因子、趋化因子、炎症细胞之间的作用等。

1．实验动物

昆明（KM）突变小鼠是我所KM封闭群小鼠繁殖过程中出现的自发突变小鼠，表型异常，全身被毛稀少，表皮增厚有皱褶。为进一步育种研究，于SPF级动物房内进行近交化培育保种，其突变表型可稳定遗传。

2．模型培育方法

KM突变小鼠种鼠F0与KM小鼠杂交繁殖得到F1代杂合小鼠；再用F1代杂合小鼠自交得到F2代；然后用F1杂合雌鼠与F2代突变雄鼠交配得到F3代；同样用同窝F3代突变雄鼠与杂合雌鼠交配得到F4代小鼠等，自F3代开始同窝互交，连续繁殖至20代，培育KM突变小鼠的近交系，使群体基因达到高度纯合和稳定遗传。

（一）KM突变小鼠的遗传特征

KM自发突变小鼠雄鼠F0与KM野生雌鼠交配得到表型正常的F1代；F1代雌雄互交得到F2代，有突变小鼠出现。目前F2代小鼠总数为227只，突变总数为65只（雌性37只，雄性28只），突变小鼠出现率为28.6%，突变雌雄的比例约为1:1；F2代突变雄鼠再与F1代雌性小鼠交配得到F3代，F3代有突变小鼠出现，F3代小鼠总数为204只，突变小鼠96只（雌性45只，雄性51只），突变小鼠出现率为47.1%，雌雄比例约为1:1；F3代突变雄鼠与表型正常雌性小鼠同窝交配得到F4代，F4代小鼠共174只，突变小鼠91只（雌性47只，雄性44只），突变小鼠出现率为51.7%，突变雌雄比例约为1:1。通过回交及测交实验表明KM突变小鼠出现率不受性别限制，突变基因不在性染色体上，进而得到KM突变小鼠皮肤及毛发性状的遗传规律可能是单基因控制的常染色体隐性遗传，与性别无关，符合孟德尔遗传规律（分离规律）。自F3代开始同窝兄妹互交至20代建立近交系KM突变小鼠品系。以F5-F8代为例，F5-F8代突变小鼠的出现率分别为50%、46.9%、51.3%和46.2%，且均无性别差异。（遗传培育结果见表1，表2，汇总表3）

表1回交结果

表2 F1, F3-F8代同窝突变雄鼠与表型正常雌鼠测交结果

表3 KM突变小鼠的近交系培育结果

（二）模型的皮肤特征：

从外部表型来看，与野生型KM小鼠相比，该突变小鼠在出生1-5天观察不到明显异常，至6-7天被毛长出后可与野生鼠区分开，野生型小鼠全身由发育良好的被毛覆盖，除爪、耳和尾之外全身呈白色外观；而突变小鼠被毛稀少不能覆盖全部皮肤，故保持粉红色外观直至离乳。成年后突变小鼠被毛稀疏，有部分小鼠颈背部、眼眶周围出现脱毛，随年龄增长逐渐消瘦，皮肤松弛，颈背部皮褶增多，偶有皮屑出现，部分小鼠的颈前部和肩胛部皮肤出现溃疡，伴有局部淋巴结增大。(图1)

图1 a.新生 KM野生小鼠（1天）b.新生KM突变小鼠（1天），两者无明显差别；c.新出生KM野生小鼠（6天），乳白色皮肤d.新出生KM突变小鼠（6天），体型小，粉红色皮肤，可与同龄野生小鼠辨别e.（3月）突变小鼠被毛稀疏，皮肤干燥、皮肤皱褶，脱屑，消瘦f.（3月龄）KM正常小鼠。

（三）、KM突变小鼠与KM野生小鼠体重测量比较

KM突变小鼠的体重在相同年龄下均低于KM野生小鼠(P<0.01，或P<0.05)，雄性间差别更显著。从小鼠生长曲线（图2）可见KM突变小鼠的体重随年龄的增长体重增长较慢，雌雄鼠均低于同龄野生KM小鼠。图中我们可看到KM突变雌雄小鼠在3W-12W内体重几乎相同，没有性别差异，12W后，雄性小鼠的体重高于雌性小鼠体重，雄性突变小鼠体重开始增加，而雌性小鼠体重无明显变化直至6月龄以后才有所增长，到7月龄之后雄性小鼠体重开始下降，雌性小鼠体重也趋于稳定。KM野生小鼠体重增长迅速，且一直在随年龄增加而增长。

图2 KM突变和KM野生小鼠体重比较

（四）KM突变小鼠日摄食、饮水测量

3、6月龄突变雌鼠、雄鼠日食量与野生鼠相比无明显差异，3月突变雌鼠日饮水量高于同龄KM雌鼠（P＜0.05），6月龄突变雄鼠日饮食量，日饮水量均较野生鼠高，其中日饮水量升高有统计学意义（P<0.05）（表4，表5）

表4 3月龄突变和野生小鼠雌雄日摄食、饮水量的比较（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；

表5 6月龄突变和野生小鼠雌雄日摄食、饮水量的比较（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01。

（五）、KM突变小鼠血常规、生化测量

KM突变小鼠血常规检测结果为：WBC计数3月龄突变雌雄鼠均高于同龄野生（P<0.05），6月龄突变鼠高于野生鼠，其中6月突变雄鼠高于同龄野生鼠有意义（P<0.01），3月龄突变鼠低于6月龄突变鼠，其中雄性有意义（P<0.05）；RBC计数3月龄突变雌鼠高于6月突变雌鼠，且3月突变雄鼠高于同龄KM鼠（P<0.01）；HGB含量3、6月龄突变雌雄鼠均低于同龄野生鼠（P<0.01），3月突变鼠高于6月突变鼠含量；MCHC为3、6月龄突变雌雄军低于同龄野生小鼠（P<0.05）；LYM计数3、6月龄突变雌雄鼠均高于同龄野生小鼠（P<0.01）,且3月突变雄鼠低于6月突变雄鼠（P<0.01）；LYM%3月龄突变雌雄鼠高于野生鼠（P<0.05），6月龄突变鼠高于野生鼠无明显意义，但3月龄突变雄鼠低于6月龄突变雄鼠（P<0.01）；MON计数3、6月龄突变雌雄鼠均高于同龄野生鼠（P<0.01）,3月龄突变雄鼠低于6月龄突变雄鼠（P<0.01）；MON%发生同样的变化；NEU3月突变雌鼠低于3月突变雄鼠（P<0.01）,3月突变雄鼠高于同龄KM鼠（P<0.01）；NEU%3、6月龄突变雌雄鼠均低于同龄野生小鼠（P<0.01）,3月龄突变雌雄高于6月龄突变雌雄鼠（P<0.01）；BSA3月突变雌鼠高于3月突变雄鼠，3月突变雄鼠低于6月突变雄鼠（P<0.05）；BAS%变化相同；ALY%3月突变雌鼠高于同龄野生鼠（P<0.01）,3月突变雄鼠低于6月突变雄鼠（P<0.01）。（见表6）

KM突变小鼠血生化检测结果为：GLU3月龄突变雌雄鼠低于3月野生小鼠（P<0.01）,6月龄突变雄鼠低于6月野生雄鼠（P<0.05），且3月突变雌鼠低于3月突变雄鼠（P<0.01）；CHO3月龄突变此雄鼠低于3月野生鼠（P<0.01），3月突变雌雄低于6月突变雌雄鼠（P<0.01）；TG含量3月突变雄鼠低于3月野生鼠，6月突变雌雄鼠低于6月野生雌雄鼠（P<0.05），3月突变雌雄鼠高于6月突变雌雄鼠（P<0.01）,3月突变雌鼠低于3月突变雄鼠（P<0.05）；HDL-C3月突变雌雄鼠低于3月野生鼠，且低于6月突变雌雄鼠（P<0.01）；LDL-C3月突变雌雄鼠高于3月野生鼠，且高于6月突变雌雄鼠（P<0.01）；IgG含量3月突变雌鼠低于6月突变雌鼠，6月突变雄鼠高于6月野生雄鼠（P<0.05）。（见表7）

表6 突变小鼠与KM小鼠主要的血常规指标比较（x±S）

同龄雌雄突变鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同龄突变鼠之间相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01；

同龄突变鼠与KM鼠相比# P＜0.05，## P＜0.01

表7 突变小鼠及KM小鼠部分血生化指标比较（x±S ）

同龄雌雄突变鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同龄突变鼠之间相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01； 同龄突变鼠与KM鼠相比#P＜0.05，## P＜0.01.

（六）模型病理特点：

组织切片HE染色结果显示KM突变小鼠表皮增厚（表8）（图3），上皮细胞角化过度伴角化不全，颗粒层增厚，基底细胞层水肿；真皮浅层血管扩张充血，炎细胞浸润，毛囊数目减少（表8），部分毛囊细胞和皮脂腺细胞变性坏死，毛囊内炎细胞浸润；皮下组织内炎细胞浸润，脂肪组织内可见多核细胞。3月龄突变小鼠皮肤组织炎症病变较重，皮下组织可见小脓肿，真皮和皮下组织弥漫性炎细胞浸润，可见大量多核细胞；6月龄小鼠皮肤炎症病变较3月龄有所减轻，有少量炎细胞浸润，胶原致密，皮下脂肪散在多核细胞。（图4）

甲苯胺蓝特染示肥大细胞：真皮层胞质中含紫红色颗粒、胞核蓝色的细胞为肥大细胞。3月龄、6月龄均较正常鼠多见，3月龄突变鼠阳性率高于6月龄（图5）

图3小鼠皮肤表皮厚度比较（HE）X100 A野生小鼠 B 突变小鼠

表8 实验小鼠皮肤表皮厚度和毛囊数目测量比较(计数/mm2) （x±S ）

与野生小鼠比较，﹡P<0.01；与6月龄野生小鼠比较，∆P<0.01

图4突变小鼠皮肤病理改变（HE）X100： A毛囊上皮细胞角化不全伴炎细胞浸润； B真皮血管扩张伴炎细胞浸润；C真皮水肿少量炎细胞浸；D真皮颗粒层增厚；E棕色脂肪周围的白色脂肪内多核细胞和多发性小脓肿；F皮下结缔组织的炎细胞浸润；G,H为对照

图5甲苯胺蓝染色示肥大细胞x200：A.3月龄突变小鼠B.3月龄野生小鼠C.6月龄突变小鼠D.6月龄野生小鼠

（七）皮肤组织炎症细胞及细胞因子改变

免疫组织化学染色对炎症细胞及细胞因子进行比较，图像分析软件计数镜下单位视野（1mm2）内阳性细胞数[2]，结果进行半定量分析，结果显示（表9）：KM突变小鼠3月龄皮肤炎症细胞CD3、CD4T细胞阳性数比3月龄KM野生小鼠多（P<0.05），主要在表皮和真皮组织；巨噬细胞表面抗原CD68、F4/80比3月龄KM野生小鼠皮肤阳性数多(P<0.05)，其主要在真皮及皮下组织；B细胞表面标记分子CD45R/B220两者存在一定差异，但差异没有统计学意义；炎症因子IL-6、IL-22、TNF-α、INF-γKM突变小鼠阳性细胞数也高于KM野生小鼠（P<0.05），这些炎症因子也主要存在于真皮及皮下组织内。6月龄KM突变小鼠炎症细胞CD3、CD4T细胞阳性数比6月龄KM野生小鼠多，主要在表皮及真皮（P<0.01）；巨噬细胞表面抗原CD68阳性细胞数比6月龄KM野生小鼠的多(P<0.01)，皮肤炎症因子IL-6、TNF-α等也表现为6月龄KM突变小鼠比同月龄KM野生小鼠阳性细胞数多（P<0.01）（图6）。KM突变小鼠3月龄和6月龄相比较：炎症细胞CD3、CD4T细胞3月龄阳性数明显比6月龄的多（P<0.01）；CD68阳性率也表现为3月龄高于6月龄，但目前未发现统计学差异；炎症因子IL-6、TNF-α3月龄的阳性细胞数明显比6月龄小鼠多，但IL-6未发现统计学差异。

表 9 小鼠皮肤炎症细胞及细胞因子的检测半定量比较（x±S ）

（八）皮肤组织细胞凋亡和增殖改变

（1）细胞凋亡改变

KM突变和KM野生小鼠9天、22天、3月龄和6月龄龄比较，各取5只，每只取5个部位，每个部位随机选择1mm2视野，记录平均阳性细胞数。结果显示四个年龄段的KM突变小鼠皮肤真皮层及毛囊周围均有不同程度细胞凋亡，其中22天时凋亡细胞数最多，真皮层及毛囊大量细胞凋亡，突变小鼠多于同龄野生小鼠，其中3月、6月突变小鼠皮肤凋亡细胞增多具有统计学意义（P<0.01）；突变9天与突变22天、6月小鼠间凋亡阳性细胞数差别分别有统计学意义（P<0.05），突变9天与突变3月，KM野生小鼠9天差别无统计学意义； 突变小鼠22天时凋亡细胞数多于突变小鼠9天和3月龄，且有统计学意义（P<0.01和P<0.05），与突变小鼠6月凋亡细胞数相比无显著性差异；突变小鼠3月、6月之间凋亡阳性细胞数差别没有统计学意义。（图7,8）

图7 小鼠皮肤凋亡染色x200 A.突变9天 B.突变22天C.突变3月D.突变6月E.野生9天F.野生22天G.野生3月H.野生6月

图8 小鼠皮肤凋亡染色统计图

（2）细胞增殖改变

取5个部位，每个部位随机选择1mm2视野，记录平均阳性细胞数。9天时，KM野生小鼠与KM突变小鼠表皮基底细胞差异无意义，但毛囊及皮脂腺阳性细胞数KM野生小鼠多于突变小鼠差别有统计学意义（p<0.01）；22天时，KM野生小鼠与KM突变小鼠相比：KM野生小鼠表皮基底细胞阳性数多、毛囊及皮脂腺阳性细胞数少，差别分别有统计学意义（p<0.01）；3月龄 表皮及毛囊染色KM野生小鼠阳性细胞数多于KM突变小鼠（P<0.01）；突变小鼠表皮基底部细胞阳性细胞数很少，毛囊及皮脂腺细胞不完全染色，而KM野生小鼠表皮基底部阳性细胞排列均匀，连续，毛囊及皮脂腺细胞完全 ；6月龄KM突变小鼠表皮毛囊阳性细胞数多于KM野生小鼠，表皮P<0.01,毛囊P>0.05；KM突变小鼠表皮基底部细胞增厚，阳性细胞增多，KM野生小鼠无太多变化，但野生小鼠毛囊阳性细胞有所减少。（图9,10）

图9小鼠皮肤增殖细胞核抗原（PCNA）染色 X200

A.野生9天B.野生22天C.野生3月D.野生6月E.突变9天F.突变22天G.突变3月H.突变6月

图10 KM野生和突变小鼠皮肤增殖细胞统计