H7N9滴鼻感染雪貂模型

2013 年3月31日，依据《国际卫生条例（2005）》，中国政府报告上海和安徽发现3例人感染新型甲型H7N9禽流感病毒（以下简称H7N9）病例。在随后的几个月内，以华东地区为代表的我国多个省市陆续确诊并报道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的病例，这是世界首次发现的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情，引起了广泛关注。

H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因，N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 个内部基因片段重配而成的新型病毒。对目前已公布了全基因组的若干H7N9禽流感患者分离株的序列分析结果显示，该病毒具有与之前其他亚型甲型流感病毒类似的遗传特征，包括对禽类低致病性，感染哺乳动物的能力增强，对金刚烷胺类抗病毒药物耐药，以及对神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦和扎那米韦）敏感。

人感染H7N9禽流感病毒后，临床表现包括发热、咳嗽、呼吸困难、乏力、肌肉酸痛、咯血及胃肠道症状，初始症状并不包括鼻塞和流涕。97%的患者出现肺炎，超过70%的患者发生急性呼吸窘迫综合症（ARDS），部分患者继而进展为顽固性低氧血症和多器官功能衰竭并导致最终死亡。少数病例为轻症，均为儿童，常常仅有发热表现。实验室检测结果显示，患者外周血白细胞正常或减少，淋巴细胞减少，血小板缺乏，以及肝酶轻度升高。约60%的病例具有各种并发症，如冠心病、糖尿病、高血压和慢性阻塞性肺病。病例以老年人（平均年龄62岁）和男性（69%）居多。

研究显示，活禽市场是人感染H7N9 禽流感病毒的可能来源。活禽暴露是人感染的关键风险因素，导致患者感染的主要暴露方式为直接接触染毒的活禽、被其排泄物污染的环境或物品。然而，目前从不同患者体内分离到的病毒株基因组序列存在一定的差异，其进化源头似乎并不相同，因此目前报道的这些病例极有可能是一些独立的感染事件。流行病学调查也为这一论点提供了部分佐证。目前已确诊的人感染病例多为散发，彼此间没有明显的流行病学关联。尽管如此，目前仍有三起疑似家庭聚集案例的报道。

基因进化分析显示，H7N9 禽流感病毒是一种新型重配病毒。虽然各基因片段分别与近期东亚地区流行的禽流感病毒同源性较高，但这种基因组成之前从未在禽、人或其他动物中发现过。其HA 基因可能源于我国长三角地区鸭群中的H7 亚型禽流感病毒，NA基因的来源目前尚无定论，早期研究认为其源于欧亚迁徙的候鸟，最新研究则指出它与2010-2011年间途径香港境内的候鸟分离到的H11N9和H2N9病毒高度同源。尽管如此，目前无异议的一致的结论是，野鸟在H7N9 禽流感病毒传播中可能扮演重要角色，鸭群则在将H7N9相关病毒从野鸟传至家禽的过程中，起到至关重要的中间宿主作用。

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

分子生物学研究显示，这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸，而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。

概括起来，相较于其他流感动物模型，雪貂的优势为 ：（1）雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。（2）人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂，这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。（3）雪貂的气管较长，这样就使其上、下呼吸道区室化，有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。（4）雪貂作为动物模型比啮齿类大，易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。（5）在小型动物中，雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。基于此，目前雪貂作为理想的流感动物模型已被广泛应用于流感发病机理等各方面的研究，为人类流感研究做出了重要贡献。

去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。实验前进行血清学检查，HI方法检测血清H7N9、H1N1、H5N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

病毒株为A/Anhui/1/2013 (H7N9)，雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染H7N9病毒。实验的观察期为14天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。

1. 雪貂模型感染后临床症状变化

雪貂感染H7N9病毒后出现典型临床症状，包括体温升高（图1）、体重降低（图2）、流涕（图3(i)）、活动度降低（图3(ii)）、食欲下降等等。其中接种108 TCID50病毒的雪貂，体温升高及体重下降的峰值分别出现在感染后第2天和第7天，达40.0℃及10.7%；而接种106 TCID50病毒的雪貂，相应的峰值则出现在第4天和第5天，分别达40.1℃及9.3%（图1、图2、表1）。

2. 雪貂模型感染后病毒在组织中复制情况

感染雪貂的上呼吸道排毒始于感染后第1天，并持续至第7天，感染108 TCID50或106 TCID50病毒雪貂的排毒峰值分别分离自第3天的咽拭子（104.38 TCID50/ml）以及第5天的鼻拭子（104.11 TCID50/ml）（图4）。感染后第3天，H7N9病毒可从全部2只被解剖雪貂的肺、气管、嗅球，以及1只雪貂的心脏中检出，而至感染后第7天，全部2只被解剖雪貂的气管和肺，以及1只雪貂的肝均可检测到H7N9病毒的存在（表2）。

3. 雪貂模型感染后组织病理损伤及肺部影像学检测

接种106 TCID50病毒的雪貂，在感染后第3天和第7天各安乐2只，进行病毒的组织分布和病理观察检测。大体解剖结果发现，感染后第3天和第7天，所有解剖雪貂的肺组织均出现多点病灶（图3 (iii)），但雪貂的脑、心脏、肝、脾、肾、胃、小肠、嗅球等均未发现肉眼可见病变。H-E染色结果证实，感染后第3天，雪貂肺组织表现局灶性中度间质性肺炎、肺泡腔内纤维素及炎细胞渗出等；而至感染后第7天，肺部病变范围进一步扩大，并出现重度间质性肺炎（图5 (iii-iv)）。免疫组化的结果证实H7N9病毒阳性抗原主要分布于感染雪貂的支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞（图5 (i-ii)）

感染108 TCID50病毒的雪貂每天进行胸腔显微CT扫描，来动态观察雪貂肺部的病变进程，结果显示感染后6-14天雪貂的右上肺叶逐渐出现轻度至双边毛玻璃样阴影的炎性损伤（图6）。

感染后第14天，对雪貂进行心脏采血以及血凝抑制实验（HI），测定对H7N9病毒的特异性抗体效价，结果证实所有接种雪貂均出现抗体转阳现象，HI效价高达160-1280。

4. 雪貂模型感染后血常规检测结果

临床研究证实，患者感染H7N9病毒后，会出现显著的白血球减少症。在雪貂模型中，我们同样观察到这一现象。与小鼠感染前相比，感染后第7天，雪貂模型出现显著降低的白细胞总数和淋巴细胞数，以及显著升高的中性粒细胞数(P<0.05，表3)。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

6.2感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。