脑室注射复合淀粉样蛋白拟阿尔茨海默病大鼠模型

众所周知，阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease, AD）是一种渐进性神经退行性疾病，主要临床上表现症状是记忆逐渐减退。病理上神经组织萎缩、神经元和突触丢失和神经亚细胞结构和功能的碍[1,2]。文献报道，动物脑室注射淀粉样蛋白(Amyloidbeta protein, Aβ)可引起神经毒性事件发生，包括神经元损失，钙稳态的破坏，神经元细胞凋亡和活性氧过度生成等[3]。然而，由于很多因素参与AD的发病机制，因此，建立一个更好AD模型是非常必要的。

本文详细地描述大鼠侧脑室注入Aβ25-35和三氯化铝(aluminumtrichloride, AlCl3 )联合丘脑前背侧核注射重组人类转移因子-β1(recombinant human transforming growth factor-β1, RHTGF-β1)（复合Aβ）建立体内模拟AD模型。这个大鼠模型高度模拟AD神经功能和组织病理，包括记忆障碍、神经元丢失和结构损伤、细胞凋亡、细胞内Aβ负重和神经纤维缠结(neurofibrillarytangles, NFT)沉积(4-9)。AlCl3阻止沉淀型Aβ向可溶性Aβ转变，RHTGF-β1能促进沉淀型Aβ大量生成促进AD的发生[10]，这几个因素对神经元的攻击与AD多病因发病机制相一致。

整个实验的86天。图1显示实验设计的时间表，包括动物外科手术、动物模型筛选、动物空间记忆检测和样品制备。手术第一天大鼠丘脑前背侧核微量注射RHTGF-β1，手术第二天开始侧脑室微量注射上午注射Aβ25-35连续14天，下午注射AlCl3连续5天。注射完所有大鼠恢复饲养45天。Morris水迷宫筛选大鼠记忆障碍投评估它们的空间记忆能力。大鼠连续4天水迷宫训练，每日训练2次，用第4天水迷宫成绩作为记忆障碍模型筛选。大鼠筛选完再饲养37 天，大鼠进行连续7天即手术后第79天~85天的Morris水迷宫空间记忆检测，在手术后第86天，所有大鼠断头处死制备样品。

1.实验材料

2.实验环境

3.实验操作过程

3.1实验动物和试剂

300-350g 4月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司。手术前承德医学院SPF级动物实验室饲养1周，室温维持在18-24℃，相对湿度(40-60%)，12 h日光灯光/暗交替光照，自由进食进水。所有操作符合《中华人民共和国实验动物管理条例》[11]。Aβ25-35用1% DMSO的生理盐水在超声波作用下彻底溶解，AlCl3 和RHTGF-β1分别用生理盐水溶解为1% 和0.1 mg/mL，刚果红、硝酸银和其他化学试剂都是分析纯，购于试剂公司。

3.2 外科手术过程

3.2.1 利用小动物麻醉机100%异氟烷通过吸入麻醉，麻醉大鼠固定在脑立体定位仪上；

3.2.2 用电动剃毛器剪掉大鼠头顶的上毛，并用碘载消毒，一次性手术孔巾盖在头上；

3.2.3 头顶皮肤用外科手术剪或刀纵向沿中线切大约1~1.5cm的口；

3.2.4 分离皮下组织和筋膜，用无菌干棉布擦拭颅骨表面并压迫止血，用记号笔标记颅骨的前囱点。

3.2.5 参照大鼠脑立体定位图谱[12]，以前囱作为原点，标记三个点。第1个点是丘脑前背侧核(ad)（前卤点后2. 0 mm，矢状缝右侧旁开1.4 mm）即是RHTGF-β1注入点（图3）。第2个点是侧脑室(LV)，前卤点后0.8 mm，矢状缝左侧旁开2.0 mm，即是Aβ25-35和AlCl3注入位点（图4）。第3个点是前卤点前2. 0 mm，矢状缝右侧旁开1.5 mm，即是固定第2个螺钉位点。

3.2.6 用柔性骨钻在三个标记点轻轻各钻一个直径1 mm孔；注意不要钻的太深，以防伤到脑组织。无菌干棉花反复擦拭颅骨进行止血和清洁头骨表面。

3.2.7 将安装在微量注射泵的微量注射器插入第一个孔，深度距颅骨4.6mm，轻轻注入1 μLRHTGF-β1 (10 ng)至ad区域，注射速度是1 μL/min，注射完针停留2 min。

3.2.8 第1和第3个点用螺丝刀各拧上1个小螺钉，不要拧的太深防治伤着脑组织。

3.2.9 导管注入系统高压消毒后进行组装，将导管帽插入导管里；用脑立体定位仪持管臂将导管插入颅顶的第2个孔；

3.2.10 将牙托粉与牙托水1.5 g:1 mL混合制备牙托基质材料，混匀后倒在颅骨上，覆盖导管和2个螺钉，直到将皮肤切口全部覆盖，以固定导管和防治皮肤感染；

3.2.11 手术第二天，小动物麻醉机异氟烷麻醉大鼠，取下导管帽，把长度是4.6mm的注射内芯插入导管里，注射内芯底端到达侧脑室位置，用塑料螺丝固定导管和注射内芯，防治内芯移动；

3.2.12 用聚乙烯软管连接注射内心和微量注射泵上的微量注射器，微量注射Aβ25-35或AlCl3到侧脑室，调节注射速度是1 μL/min；

3.2.13 从手术第二天开始，大鼠在异氟烷麻醉状态下，上午微量注射 4 μg(1 μL) Aβ25-35，连续注射14 天；下午注射3 μL AlCl 3 (1%)，连续注射 5 天。 每次注射完等待5 min，轻轻地拔出注射内芯，再插入导管帽；

3.2.14 在手术的第15天，即末次注射Aβ25-35，拆导管系统。用外科手术剪和镊子出掉牙托基质材料，用碘伏清理伤口，骨水泥填充颅骨孔，简单缝合法缝合皮肤；

3.2.15 假手术组大鼠做同样的手术，微量注射0.1%DMSO盐水。

3.3术后护理

3.3.1 大鼠术后每2只在一个笼子中饲养，自由饮水饲养30天；

3.3.2 手术成功率90%以上。

3.4Morris水迷宫进行成功模型筛选和空间记忆的检测

3.4.1 Morris 水迷宫

Morris水迷宫用于检测大鼠的空间记忆^{[13]。迷宫是一个直径是120 cm高度是50 cm的不锈钢圆池子，检测基于J. Nunez（2008）的行为神经科学的“金标准”[14]。}

3.4.1.1 用黑色食用色素将池子的水染成浓黑；保持水高度是31.5cm，水温23 ± 1 °C；

3.4.1.2 水池里放置一个直径10cm、高度30 cm的有机玻璃平台，使其在水面下1.5cm；

3.4.1.3 在水迷宫测试期间，保持水迷宫周围所有空间信号不变；

3.4.1.4 为了描述收集数据，人为想象将迷宫分为四个象限；检测时将平台放在第一象限。

3.4.1.5 通过摄像头与电脑连接的采集软件摄取大鼠游泳行为，包括潜伏期、游泳轨迹和平台穿越次数等；

3.4.2 成功模型筛选及空间记忆测定

大鼠术后第45天，利用Morris水迷宫进行记忆障碍模型筛选，筛选的方法是所有大鼠每日在Morris水迷宫中游泳连续训练2次，以2次游泳成绩均值作为大鼠当天训练成绩，连续训练4天，以第4天大鼠训练成绩作为模型成功筛选指标。假定Morris水迷宫训练第4天，某只脑室注射复合Aβ大鼠找到平台的潜伏期是A、假手术组大鼠找到平台的潜伏期是B，筛选率（Screening ratio,SR）SR=(A-B)/B，当某只脑室注射复合Aβ大鼠的SR值大于0.2时，则说明这只大鼠空间记忆障碍，即为拟AD模型成功大鼠。

水迷宫检测大鼠空间记忆能力，连续测试6天，每天测试2次。每天第一次测试，将大鼠自离平台的远端面向池壁放入水中，记录大鼠自放入水至找到平台的时间（即潜伏期：Latency），如果大鼠在60s内找到平台，让大鼠在平台上呆20秒；如果大鼠在60秒内没有找到平台，实验者将其放到平台上停留20秒，潜伏期记为60秒。第二次测试是大鼠自离平台近端面向池壁放入水中，两次测试中间令大鼠离开迷宫休息10秒，每天测试2次潜伏期的平均值，作为大鼠当天的测试成绩。

3.5 神经元检测

3.5.1 在手术第86天，异氟烷麻醉下，大鼠断头处死；

3.5.2 取出大脑放在冰上，沿大脑中缝分开，左半球4%甲醛固定，用于测定HE染色、刚果红染色和硝酸银染色观察神经元；右侧大脑分离海马，戊二醛固定用于电镜检测亚细胞结构。

3.5.3 神经元HE染色

（1）石蜡切片机连续冠状切片(4μm)，贴片，烤片；

（2）二甲苯脱蜡，梯度酒精浸水；

（3）苏木精染色3-5min，水洗，去浮色；

（4）0.1%盐酸酒精分色1-2s，1%氨水反蓝2min；

（5）0.5%伊红1min；

（6）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察细胞形态学变化。

3.5.4 刚果红染色检测神经元Aβ负载

（1）切片二甲苯脱蜡，梯度酒精浸水；

（2）刚果红染液，用碱性乙醇分化液分化；

（3）苏木精复染，蒸馏水水洗，梯度酒精脱水；

（4）二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜观察Aβ刚果红红染细胞情况并拍片。

3.5.5 神经纤维缠结硝酸银法测定NFT

（1）切片二甲苯脱蜡，梯度酒精浸水；

（2）浸入20%的硝酸银（加盖）避光染20min，蒸馏水浸洗；

（3）浸入银氨液染15min，移入稀氨水中浸泡；

（4）把切片浸入显影工作液显色3~7min，直到在金黄色背景下，见神经轴突呈黑色即取出；

（5）切片置入上述用过的稀氨水内浸洗1min，流水冲洗1min；

（6）5%的硫代硫酸钠处理2min，流水冲洗5min；

（7）常规脱水透明，中性树胶封片；显微镜下观察NFT硝酸银染色情况并拍片。

3.5.6 海马超微结构测定

（1）大鼠海马切成1*1*1mm3小块，2.5%戊二醛4°C固定2h；

（2）pH7.2磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸4°C后固定2h；

（4）超纯水冲洗，梯度酒精脱水；

（5）置换：环氧丙烷2次，每次15min；环氧丙烷：树脂==1:1室温1h；环氧丙烷：树脂=1:4室温1h；纯树脂浸透室温2h；

（6）纯树脂包埋(EPON812)：聚合，修块；

（7）半薄切片天青-美兰染色，光镜下定位观察；

（8）超薄切片醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色；

（9）JEOL100CX-Ⅱ型透射电镜观察亚细胞结构并拍片。

4. 结果

4.1脑室注射复合Aβ建立拟AD大鼠记忆障碍成功模型筛选

所有大鼠进行4d水迷宫训练，进行记忆障碍成功模型筛选。图2显示，所有大鼠在4 d的水迷宫训练中找到平台的潜伏期都随着训练天数的增加逐渐缩短。根据脑室注射复合Aβ的每只大鼠和假手术组大鼠，在第4天水迷宫训练成绩计算的SR值大于0.2[15]，本实验脑室注射Aβ25-35联合AlCl3和RHTGF-β1大鼠记忆障碍模型成功率为94.7%。

A：适应性游泳游泳轨迹. (AA1-AA2) 假手术组; (AB1-AB2)复合Aβ组.

B：假手术组和复合Aβ组大鼠水迷宫训练4天找到平台潜伏期的平均值

4.2脑室注射复合Aβ引起大鼠记忆获得和记忆再现障碍

定向航行实验用于检测大鼠记忆获得。大鼠Morris水迷宫测试第1天和第2天即手术的第79天和80天进行定向航行实验。2天的水迷宫测试发现，所有大鼠显示找到平台的潜伏期逐渐降低，图3所示，复合Aβ大鼠找到平台的潜伏期比假手术组分别增加了360.67%和558.28% (F (1,5) = 238.67, p < 0.01)。表明，复合Aβ可以引起大鼠记忆获得障碍。

对侧实验检测大鼠的记忆再现。大鼠Morris水迷宫测试第4、5和6天即手术的第82、83和84天进行对侧实验。图3所示，复合Aβ大鼠找到平台的潜伏期比假手术组分别增加了306.20%、650.16%和 936.92% (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01)。表明，复合Aβ可以引起大鼠记忆再现障碍。

Morris水迷宫测试第1天和第2天即手术的第79天和80天进行定向航行实验检测大鼠记忆获得。Morris水迷宫测试第4、5和6天即手术的第82、83和84天进行空间探索实验检测大鼠记忆再现。图上的点是各组大鼠Morris水迷宫找到平台的潜伏期的均值。数据采用One-Way方差分析(组×天) ，用均值 ± 标准差表示，n = 6，** p < 0.01, 与假手术组比较。

4.3 复合Aβ引起大鼠记忆保持障碍

探索实验用于检测大鼠的记忆保持。在水迷宫测试第3天即手术第81天进行1天的大鼠记忆保持。大鼠60秒在第1象限游泳时间、游泳路程和穿越次数分别是假手术组大鼠的32.14%, 30.11%,and 78.95% (p < 0.01)，结果表明，复合Aβ可以引起大鼠记忆再现障碍。(图 4A, 4B)

大鼠的记忆保持。在水迷宫测试第3天即手术第81天进行1天的探索实验检测大鼠记忆保持。复合Aβ组大鼠60秒在第1象限游泳时间、游泳路程和穿越次数分别是假手术组大鼠的32.14%,30.11%,和78.95%(p < 0.01)，该结果显示，复合Aβ可以引起大鼠记忆再现障碍。A：大鼠60秒在第1象限游泳时间、游泳路程和穿越次数。数据采用One-Way方差分析(组×天) ，用均值 ± 标准差表示，n = 6，** p < 0.01, 与假手术组比较。B：大鼠探索实验游泳轨迹。假手术组,显示在目标象限长的游泳时间和路程，复合Aβ大鼠短的游泳时间和短的游泳路程。

4.4 复合Aβ对大鼠游泳速度影响

在水迷宫测试第7天即手术后第85天测定大鼠游泳速度，两组大鼠基于找到平台的游泳路程和游泳时间的游泳速度没有显著性差异。因此，排除了大鼠因游泳技能的个体差异所致大鼠行为学的影响(图 5)。

两组大鼠基于找到平台的游泳路程和游泳时间的游泳速度没有显著性差异。数据采用One-Way方差分析 ，用均值 ± 标准差表示。

4.5 复合Aβ引起神经结构异常改变

在手术后第86天，所有大鼠断头处死，肉眼观察大鼠大脑组织学变化，发现复合Aβ大鼠大脑质量降低，皮质表面发黄，部分鼠皮层塌陷变薄，部分鼠累及整个大脑。HE染色发现复合Aβ大鼠神经细胞病理学改变，海马细胞明显丢失，CA1区锥体细胞有的胞体肿胀，排列稀疏不整齐，细胞带断裂不完整，胶质细胞增多且伴有噬神经现象；有的皮层出现典型的液化性坏死，坏死区神经异常改变。细胞膜破裂、核溶解、且有大量炎性细胞浸润。表明，复合Aβ可以引起神经结构异常改变。

A：海马和大脑皮层神经元HE染色。（A1-B1）海马40×；（A2-B2）海马CA1 400×；（A3-B3）大脑皮质400×；（A1-A3）假手术组；（B1-B3）复合Aβ组；海马细胞明显丢失，CA1区锥体细胞有的胞体肿胀，排列稀疏不整齐，细胞带断裂不完整，神经纤维变性（→），胶质细胞增多且伴有噬神经现象噬神经现象（←）；有的皮层出现典型的液化性坏死(★)，坏死区神经异常改变，细胞膜破裂、核溶解、且有大量炎性细胞浸润。

B：在光镜下计数海马和大脑皮层HE染色的神经元数量（400×），** p<0.01，与假手术组相比。

4.6 复合Aβ引起神经元亚细胞结构改变

电镜观察海马神经元亚细胞结构。图B1-B4是复合Aβ组大鼠海马电镜检测结果。发现神经细胞严重受损，线粒体肿胀、嵴断裂，有的电子密度增高；粗面内质网扩张、高尔基体基本正常、聚核糖体解聚、微管解聚、次级溶酶体和大量脂褐素沉积；胞核膜粗糙凹陷、常染色质凝聚变性(图B1)；髓鞘板层变薄或有松散，内部轴索和纤维萎缩；星型胶质细胞水肿、核膜及核内染色质基本正常、核仁边移且有核仁相随染色质聚集；包内有大量GFAP(图B2)；线粒体密度增加或聚集，亦有肿胀峭断裂；髓鞘(少突胶质细胞突起末端的扁平薄膜包裹神经元轴突而形成的，功能是起绝缘作用，保证神经冲动正常快速传导)大部分破坏，有的板层溶解变薄，鞘内轴索和髓神经纤维减退，表明少突胶质细胞受损，大量初级溶酶体及次级溶酶体。神经毡内毛细血管基本正常，周围星型胶质细胞足突水肿、线粒体密度增加或聚集，血管内皮紧密连接(tightjunction, TJ)宽度正常，表明该损伤是由于神经毒引起的，而非血管性损伤引起的，周细胞异染色质增多且边移。树突肿胀，突触数量不少，但突触连接部位很短，突触小泡极少。突触前膜存在大量的兴奋性神经递质，是神经毒造成的（B3-B4）。

A1-A4：假手术组：A1=4 µm，12000×；A2=3 µm，15000×；A3=5 µm，10000×；A4=1µm，3500×。

B1-B4复合Aβ组

B1：神经元和细胞核 (←)，常染色质聚集或变性(#)，星形胶质细胞足肿胀(*)，高电子密度线粒体 (▲)，髓鞘层疏松或衰减 (→)；

B2：大量GFAP，高电子密度线粒体(▲)，髓鞘层疏松或衰减 (→)，大量的次级溶酶体 (↑)；

B3：周细胞固缩，周细胞常染色质浓缩或变性(#)，星形胶质细胞足肿胀(*)，高电子密度线粒体(▲)，大量脂褐素(↓)，髓鞘层松脱或衰减(→)；

B4：大量兴奋性神经递质(##)，线粒体高电子密度或膜损伤 (▲)，突触较少。

比例尺：B1, B2 =10 µm，5000×；B3 = 5 µm，8,000×；B4 = 1 µm，40,000×

4.7 复合Aβ引起大鼠脑内Aβ异常沉积

4.8 复合Aβ引起大鼠神经元NFT沉积

硝酸银染色检测神经元NFT的沉积。图9A显示，复合Aβ能明显地引起大鼠海马和皮层细胞内NFT棕色颗粒沉积；复合Aβ大鼠海马和皮质NFT棕染阳性细胞数分别是假手术组的9.75倍和4.82倍（p<0.01）（图9B），表明，复合Aβ能增加大鼠神经元NFT沉积。

A：硝酸银染色检测海马和皮层神经元NFT沉积情况。A1-A2：假手术组，B1-B2：复合Aβ组；A1-B1：海马400×，A2-B2：大脑皮质400×。硝酸银染色显示复合处理组NFT阳性细胞较多。比例尺=10 μm，400×。

B：海马和皮质硝酸银染色阳性NFT神经元数（400×），n=3，9个视野。** p<0.01，与假手术相比。

5.讨论

我们知道，AD病人临床主要症状是学习记忆障碍。本动物模型提供了详细的数据，包括动物手术成功率和模型成功率高、动物出现记忆障碍（包括记忆获得、记忆保持和记忆再现障碍）、神经元损伤、Aβ和NFT沉积，能够模拟AD的病理生理和神经功能的异常改变，本模型曾用于AD药物筛选[4]。由此可见，脑室注射Aβ25-35 联合AlCl3 和RHTGF-β1在实验室建立了一个可行、可信模拟AD的动物模型用于研究AD的病理生理和药物筛选。

研究发现，AD病人脑体积比正常健康人减少10%，脑半球萎缩，且萎缩程度与记忆障碍成正相关[16]。形态学上，AD病人大量的神经元丢失和严重的神经病理改变都破坏记忆功能[17]。本动物模型脑室注射复合Aβ明显引起神经病理学改变，包括神经元丢失、神经细胞和亚细胞结构破坏，它们造成空间记忆障碍，且和AD病人表现相一致。

神经细胞Aβ 和NFT沉积是AD病人特征性神经病理改变，它们破坏神经细胞结构、干扰信号转导、损害神经功能，最终导致痴呆。本动物模型发现脑内Aβ 和NFT沉积，与AD病人神经改变相一致，表明，脑室注射复合Aβ可以作为AD模型去研究AD病理生理和治疗策略。

下面是用该模型筛选药物的实例，赵泓翔研究发现，黄芩茎和叶黄酮类化合物(SSF)和半枝莲黄酮 (SBF)可以减轻复合Aβ所致大鼠记忆障碍和神经细胞细胞凋亡[8,9]。郭可也报道，SBF可以抑制非NFT聚集和tau蛋白Ser199、Ser214、Ser202、Ser404和Thr231过度磷酸化，减少GSK-3β、CDK5和PKA mRNA和蛋白质表达[18]。商亚珍也报道，SBF可以抑制复合Aβ所致星形胶质细胞和小胶质细胞增殖，降低Aβ1-40、Aβ1-42和β-分泌酶的 mRNA表达[19]。基于上述结果，我们的AD动物模型在神经结构和功能上的障碍优于其他AD模型。

关于其他的AD动物模型，大鼠脑室单纯注射Aβ会出现记忆障碍、神经元丢失、神经胶质细胞增生，脑内Aβ和NFT沉积可能有或没有[20]。大鼠暴露于大剂量Al建立AD模型，动物出现记忆障碍、神经元丢失、神经胶质细胞增生、老人斑(SP)和NFT沉积，是一个模型成功率高，且经济有效的动物模型。然而，大剂量铝可能引起大鼠肝脏损伤和厌食症，且伴有体重下降[21]。另外，老年拟AD模型也出现记忆缺失，神经细胞和亚细胞结构病理改变，脂褐质沉积、但没有Aβ和NFT沉积。大鼠超过24个月的年龄可以作为AD的模型，但它需要喂养时间长，成本高[22]。SAMP8和APP转基因鼠是最接近模拟AD，是最理想的AD模型，但它们价格太高[23,24]。与上述动物模型相比，本动物模型是一个低成本和高模拟研究AD的理想模型。

总之，大鼠脑室注射Aβ25-35 联合AlCl3 和RHTGF-β1体内提供了一个有价值的动物模型来更好地理解AD空间记忆障碍、神经损伤、脑内Aβ和NFT沉积。该草案提供了一个快速、简单、经济、手术成功率高、模型成功率高和复制率高的AD模型制备，为AD的研究提供非常有价值的工具。

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1. 大鼠侧脑室注入Aβ25-35和三氯化铝(aluminumtrichloride, AlCl3 )联合丘脑前背侧核注射重组人类转移因子-β1 (recombinanthuman transforming growth factor-β1, RHTGF-β1)（复合Aβ）建立体内模拟AD动物模型，在整体水平评价动物空间记忆功能、器官水平观察脑组织神经病理学改变、细胞水平观察神经元细胞结构和亚细胞结构变化，反映模型的模拟程度；通过抗AD药物研究。在分子水平脑内Aβ1-42、Aβ1-40、tau蛋白及其相关酶GSK-3β、CDK-5和PKA等。该模型制备方法简单、重复率高、成模率高，仪器设备及条件易得。

2. 本团队重复验证4批次，阳性对照药银杏叶片获得阳性结果。

动物模型的制备是在承德医学院SPF级实验动物中心屏障室完成，各方面条件与方法符合中华人民共和国实验动物管理办法相关法律规定。

在模型制备方法后面已经对模型的指标体系、与国内外其他模型比较、创新型和应用价值进行了总结。