赖氏法丙氨酸转氨酶测定

技术概述

赖氏法丙氨酸转氨酶测定是一种经典的酶活性检测方法，在临床检验和医学诊断领域具有重要的应用价值。丙氨酸转氨酶（ALT），又称谷丙转氨酶（GPT），是人体内一种重要的代谢酶，主要存在于肝细胞中。当肝细胞受损时，ALT会释放入血，导致血清中ALT活性升高，因此血清ALT活性测定是肝脏疾病诊断和监测的重要指标之一。

赖氏法是由Reitman和Frankel于1957年建立的一种测定血清转氨酶活性的比色方法，该方法以其操作简便、结果可靠、成本相对较低等优点，在临床实验室得到了广泛应用。赖氏法测定ALT的基本原理是：ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应，生成丙酮酸和谷氨酸。生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性条件下呈红棕色，其颜色深浅与丙酮酸含量成正比，通过比色测定即可计算出ALT的活性。

与其他ALT测定方法相比，赖氏法具有独特的特点和优势。首先，该方法不需要特殊的仪器设备，普通分光光度计即可完成检测，这使得基层医疗机构也能开展此项检查。其次，赖氏法的试剂相对稳定，保存期较长，有利于实验室的日常管理工作。此外，该方法经过数十年的应用和改良，技术成熟度高，结果具有较好的可比性和重复性。

随着检验医学的不断发展，虽然出现了连续监测法等新型检测方法，但赖氏法仍然是许多实验室特别是基层医疗机构进行ALT检测的重要方法。了解赖氏法丙氨酸转氨酶测定的原理、方法及注意事项，对于从事临床检验工作的人员以及关注肝脏健康的普通大众都具有重要的意义。

检测样品

赖氏法丙氨酸转氨酶测定主要采用血液样品进行检测，不同类型的血液样品在检测中具有不同的特点和要求。正确采集和处理样品是确保检测结果准确可靠的重要前提。

血清样品是赖氏法ALT测定最常用的样品类型。血清是指血液凝固后析出的液体成分，不含凝血因子。采集血清样品时，通常采用静脉穿刺技术，将血液收集于不含抗凝剂的采血管中。血液采集后应在室温下静置30-60分钟，待血液完全凝固后进行离心分离。离心条件一般为3000-4000转/分钟，离心时间10-15分钟。分离得到的血清应为淡黄色透明液体，如有溶血、脂血或黄疸等情况，应在报告中注明，因为这些因素可能影响检测结果。

血浆样品也可用于ALT测定，但需要注意抗凝剂的选择。常用的抗凝剂包括肝素、EDTA等。肝素抗凝血浆是较为常用的选择，但需注意某些抗凝剂可能对酶活性产生干扰。血浆样品采集后应立即混匀并离心分离，避免血细胞代谢对检测结果的影响。

样品的保存和运输条件对检测结果的准确性至关重要。新鲜分离的血清或血浆样品在室温下可保存数小时，但最好在采集后2小时内完成检测。如需短期保存，可将样品置于4℃冰箱中，保存时间不宜超过24小时。长期保存需将样品置于-20℃或更低温度冷冻。需要特别注意的是，样品应避免反复冻融，因为反复冻融可能导致酶活性降低，影响检测结果的准确性。

在样品采集过程中，还需注意以下事项：采集前应告知患者相关准备要求，如避免剧烈运动、禁食一定时间等；采血时应规范操作，避免溶血；采血量应充足，以满足检测需要；样品应做好标识，确保信息准确无误。

• 血清样品：最常用，血液凝固后离心分离获得
• 血浆样品：需使用抗凝剂，采集后立即分离
• 样品室温保存不超过数小时
• 4℃冷藏保存不超过24小时
• 长期保存需-20℃冷冻
• 避免反复冻融

检测项目

赖氏法丙氨酸转氨酶测定作为肝功能检查的重要组成部分，涉及多个相关的检测项目和指标。了解这些项目及其临床意义，有助于更全面地评估肝脏健康状况。

丙氨酸转氨酶（ALT）活性测定是本检测的核心项目。ALT主要存在于肝细胞胞质中，当肝细胞膜通透性增加或肝细胞坏死时，ALT释放入血，导致血清ALT活性升高。因此，血清ALT活性是反映肝细胞损伤的敏感指标。赖氏法测定ALT活性的结果通常以卡门单位或赖氏单位表示，正常参考范围因实验室和具体方法而异，一般成人血清ALT活性正常参考值小于25卡门单位。不同的实验室可能建立有自己的参考范围，应根据具体情况判断结果的临床意义。

天门冬氨酸转氨酶（AST）活性测定常与ALT同时检测。AST存在于多种组织中，包括肝脏、心脏、骨骼肌等，其在肝脏中主要存在于线粒体和胞质中。AST与ALT的比值对于鉴别诊断具有重要价值。AST/ALT比值大于1常见于酒精性肝病、肝硬化等；AST/ALT比值小于1则常见于急性病毒性肝炎。因此，同时测定ALT和AST并计算其比值，可以提供更多的诊断信息。

γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活性测定也是肝功能检查的重要项目。γ-GT主要存在于肝细胞膜和微粒体中，是反映胆汁淤积和肝脏占位性病变的敏感指标。在酒精性肝病中，γ-GT常明显升高，与ALT、AST联合检测可以更好地评估肝脏损伤的性质和程度。

碱性磷酸酶（ALP）活性测定对于鉴别黄疸类型具有重要价值。ALP主要存在于肝脏、骨骼、肠道等组织中。在胆汁淤积性黄疸时，ALP常明显升高；而在肝细胞性黄疸时，ALP升高不明显。因此，ALT与ALP联合检测有助于黄疸的鉴别诊断。

除了上述酶学指标外，肝功能检查还包括总胆红素、直接胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白等指标的测定。这些指标与ALT等酶学指标相互补充，共同构成完整的肝功能评估体系。

• 丙氨酸转氨酶（ALT）：反映肝细胞损伤的敏感指标
• 天门冬氨酸转氨酶（AST）：与ALT比值可用于鉴别诊断
• γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）：反映胆汁淤积的指标
• 碱性磷酸酶（ALP）：鉴别黄疸类型的指标
• 总胆红素、直接胆红素：评估胆红素代谢
• 总蛋白、白蛋白、球蛋白：评估肝脏合成功能

检测方法

赖氏法丙氨酸转氨酶测定的检测方法具有严格的操作规程和技术要求。掌握正确的检测方法对于获得准确可靠的检测结果至关重要。下面详细介绍赖氏法的检测原理、操作步骤及质量控制要点。

检测原理：赖氏法测定ALT的基本原理基于酶促反应和比色反应的结合。ALT催化丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，生成丙酮酸和谷氨酸。反应式为：L-丙氨酸+α-酮戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸。生成的丙酮酸在碱性条件下与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙。该产物在碱性溶液中呈红棕色，在波长505nm处有吸收峰，其吸光度与丙酮酸含量成正比，通过测定吸光度即可计算ALT活性。

试剂准备：赖氏法所需的主要试剂包括：基质液（含L-丙氨酸和α-酮戊二酸的磷酸盐缓冲液，pH7.4）、2,4-二硝基苯肼溶液（浓度约为1mmol/L，溶于2mol/L盐酸中）、氢氧化钠溶液（浓度约为0.4mol/L）、丙酮酸标准液。试剂的配制应严格按照规程进行，确保浓度和pH值准确。基质液应在4℃保存，使用前恢复至室温。

操作步骤：

第一步，样品准备。取待测血清样品，确保样品新鲜或保存适当。如有溶血、脂血等情况应记录并在报告中说明。

第二步，反应体系建立。取两支试管，分别标记为测定管和对照管。测定管加入基质液0.5mL和血清0.1mL，对照管加入基质液0.5mL。两管均置于37℃水浴中预温5分钟。

第三步，酶促反应。预温后，测定管继续在37℃水浴中准确反应30分钟。反应时间应严格控制，可使用计时器确保准确性。

第四步，终止反应。反应完成后，测定管和对照管各加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5mL，测定管再加入血清0.1mL（使两管血清量相等）。

第五步，显色反应。将两管置于37℃水浴中保温20分钟，使丙酮酸与2,4-二硝基苯肼充分反应。

第六步，测定吸光度。反应完成后，各管加入氢氧化钠溶液5mL，混匀后室温放置10分钟，在505nm波长处测定吸光度。以对照管调零，测定测定管的吸光度。

第七步，结果计算。根据吸光度值从标准曲线上查得相应的ALT活性单位。标准曲线的制作采用丙酮酸标准液系列稀释后，按照相同方法显色测定。

质量控制：为确保检测结果的准确性和可靠性，应建立完善的质量控制体系。包括：室内质量控制，使用质控品进行日常质量控制，绘制质控图，及时发现和纠正偏差；室间质量评价，参加室间质评活动，与同行实验室进行结果比对；试剂质量控制，定期检查试剂的有效期和质量，新批号试剂应进行验证；仪器质量控制，定期校准分光光度计，确保波长和吸光度读数准确。

影响因素：多种因素可能影响赖氏法ALT测定的结果。溶血样品因含有红细胞内的酶和物质，可能干扰检测结果；高脂血症可使血清浑浊，影响比色测定；某些药物可能诱导或抑制酶活性，应在报告中说明；样品保存不当可能导致酶活性降低。因此，在检测过程中应注意排除这些干扰因素。

• 反应温度：37℃，需准确控制
• 反应时间：30分钟，需准确计时
• 测定波长：505nm
• 样品要求：避免溶血、脂血
• 质量控制：室内质控和室间质评
• 结果单位：卡门单位或赖氏单位

检测仪器

赖氏法丙氨酸转氨酶测定所需的仪器设备相对简单，但每种仪器都有其特定的技术要求和使用规范。正确选择和使用检测仪器，是保证检测质量的重要环节。

分光光度计是赖氏法ALT测定的核心仪器。分光光度计的基本原理是利用物质对特定波长光的吸收特性进行定量分析。赖氏法测定ALT时，需要在505nm波长处测定吸光度，因此分光光度计应具备可见光区的测定能力。常用的分光光度计类型包括单光束分光光度计和双光束分光光度计。单光束分光光度计结构简单、相对较低，适合基层实验室使用；双光束分光光度计可同时测定样品和参比，可消除光源波动等因素的影响，测定精度更高。

分光光度计的性能指标直接影响检测结果的准确性。主要技术指标包括：波长准确度，应定期用标准滤光片或标准溶液校验；吸光度准确度，可用标准溶液验证；波长重复性，反映仪器测量的稳定性；杂散光，应控制在一定范围内。日常使用中应注意仪器的维护保养，定期清洁光学部件，避免灰尘和污染影响测定结果。

恒温水浴箱用于控制酶促反应的温度。赖氏法要求反应温度为37℃，温度的准确性和稳定性对检测结果有重要影响。酶促反应对温度敏感，温度变化会影响反应速率，从而影响检测结果。因此，恒温水浴箱应具备良好的温度控制系统，温度波动范围应控制在±0.5℃以内。使用前应预热至设定温度，用水银温度计或电子温度计验证实际温度。

移液器用于准确量取试剂和样品。赖氏法ALT测定涉及多种试剂和样品的准确量取，移液器的准确性直接影响检测结果的可靠性。常用移液器包括单道移液器和多道移液器，量程范围应根据实际需要选择。移液器应定期校准，建立校准记录。使用时应采用正确的操作方法，如垂直握持、缓慢吸液和放液、避免产生气泡等。

离心机用于血液样品的分离。血液采集后需要离心分离血清或血浆，离心机的性能影响样品的分离效果。常用离心机类型包括普通离心机和高速离心机。离心条件一般为3000-4000转/分钟，离心时间10-15分钟。离心机应定期维护，检查转子和离心管是否有损坏，确保运行平稳。

计时器用于准确控制反应时间。酶促反应需要准确控制反应时间，计时器的准确性很重要。可选择电子计时器或机械计时器，建议使用准确到秒的电子计时器。使用前应检查计时器是否工作正常，计时是否准确。

除了上述主要仪器外，实验室还应配备冰箱（用于试剂和样品保存）、pH计（用于缓冲液配制）、分析天平（用于试剂称量）等辅助设备。所有仪器设备都应建立档案，记录购置、验收、使用、维护、校准等信息，确保仪器处于良好的工作状态。

• 分光光度计：核心测定仪器，测定波长505nm
• 恒温水浴箱：控制反应温度37℃
• 移液器：准确量取试剂和样品
• 离心机：分离血清或血浆
• 计时器：控制反应时间
• 冰箱：保存试剂和样品

应用领域

赖氏法丙氨酸转氨酶测定在多个领域具有广泛的应用，主要包括临床诊断、健康体检、疾病监测、流行病学研究等方面。该方法的广泛应用体现了其在肝功能评估中的重要价值。

临床诊断领域是赖氏法ALT测定最主要的应用领域。在肝脏疾病的诊断中，ALT是反映肝细胞损伤最敏感的指标之一。急性病毒性肝炎时，ALT常在发病早期即明显升高，峰值可达正常上限的数十倍，对于早期诊断具有重要价值。慢性肝炎患者的ALT可呈轻度或中度升高，且波动较大，动态监测ALT变化可以评估疾病活动性和治疗效果。肝硬化患者ALT可正常或轻度升高，但AST升高更明显，AST/ALT比值常大于1。肝细胞癌患者ALT可轻度升高或正常，但常伴有AFP等其他指标的异常。酒精性肝病时ALT轻度升高，而γ-GT和AST升高更明显，AST/ALT比值常大于2。

健康体检领域中，ALT测定是肝功能检查的常规项目。随着人们健康意识的提高，定期体检已成为健康管理的常态。在健康体检中发现ALT异常升高，可能提示存在肝脏疾病或肝脏损伤风险，需要进一步检查明确原因。体检中ALT异常的常见原因包括：脂肪肝、酒精性肝病、药物性肝损伤、慢性病毒性肝炎等。通过体检筛查，可以早期发现肝脏疾病，及时干预治疗。

疾病监测领域中，ALT测定用于评估治疗效果和监测疾病进展。对于接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者，定期监测ALT可以评估治疗效果，指导治疗方案的调整。对于使用潜在肝毒性药物的患者，如抗结核药物、化疗药物等，定期监测ALT可以及早发现药物性肝损伤，必要时调整用药方案。对于肝移植术后患者，ALT监测有助于早期发现移植肝的损伤和排斥反应。

职业健康监护领域中，ALT测定用于评估职业性肝脏损伤。某些职业接触有害因素，如化工行业接触有机溶剂、重金属等，可能造成肝脏损伤。定期进行肝功能检查，包括ALT测定，是职业健康监护的重要内容。通过定期监测，可以早期发现职业性肝损伤，采取防护措施，保护劳动者健康。

临床药物试验领域中，ALT测定是评估药物安全性的重要指标。在新药研发过程中，肝功能安全性是必检项目。通过监测受试者ALT变化，可以评估药物对肝脏的影响，为药物安全性评价提供依据。临床试验中常采用统一的检测方法和标准，确保结果的可靠性和可比性。

流行病学研究领域中，ALT测定用于研究肝脏疾病的流行病学特征。在大规模人群调查中，ALT是评估肝脏疾病负担的重要指标。通过ALT检测，可以了解人群中肝脏疾病的患病率、分布特征、危险因素等，为制定防治策略提供依据。

基层医疗机构中，赖氏法ALT测定因其设备要求低、操作简便、成本较低等优点，仍然是肝功能检查的重要方法。在社区卫生服务中心、乡镇卫生院等基层医疗机构，赖氏法ALT测定为肝脏疾病的初步筛查和诊断提供了重要手段。

• 临床诊断：肝脏疾病的诊断和鉴别诊断
• 健康体检：肝脏疾病的早期筛查
• 疾病监测：治疗效果评估和疾病进展监测
• 职业健康：职业性肝损伤的监护
• 药物试验：药物安全性评价
• 流行病学研究：疾病负担评估
• 基层医疗：肝脏疾病初步筛查

常见问题

在赖氏法丙氨酸转氨酶测定的实际应用中，可能遇到各种问题。了解这些问题的原因和解决方法，有助于提高检测质量和结果的准确性。

问题一：检测结果异常偏高或偏低

原因分析：检测结果异常可能有多种原因。样品因素如溶血、脂血、黄疸等可能干扰检测；试剂因素如试剂变质、配制错误、过期等可能影响结果；操作因素如反应时间不准确、温度控制不当、加样错误等可能导致结果偏差；仪器因素如分光光度计波长不准、吸光度读数误差等也可能影响结果。

解决方法：首先检查样品质量，如有明显溶血、脂血等应重新采集样品；检查试剂是否在有效期内，配制是否正确；复核操作步骤是否规范；校准仪器设备。如仍无法确定原因，可使用质控品进行验证，或送其他实验室进行比对检测。

问题二：标准曲线线性不好

原因分析：标准曲线线性不好可能影响结果的准确性和可靠性。可能原因包括：丙酮酸标准液配制不准确或已变质；标准液稀释系列不准确；显色反应不完全或过度；分光光度计波长漂移或灵敏度下降等。

解决方法：重新配制丙酮酸标准液，确保浓度准确；检查稀释操作是否规范；验证显色反应条件是否适当；校准分光光度计。建立标准曲线时，应确保相关系数达到要求（一般要求r大于0.99）。

问题三：室内质控失控

原因分析：室内质控失控是实验室常见问题，可能提示检测系统存在问题。失控可能原因包括：质控品质量问题如溶解不当、保存不当、过期等；试剂批号更换后未重新验证；仪器设备故障或漂移；环境因素如温度、湿度变化等；操作人员更换或操作不规范等。

解决方法：首先分析失控类型（随机误差或系统误差），判断可能原因。如为质控品问题，更换新质控品重新检测；如为试剂问题，检查试剂配制和保存；如为仪器问题，进行仪器维护和校准；如为操作问题，加强培训和规范操作。查明原因后应采取纠正措施，并记录在案。

问题四：样品检测结果为负值

原因分析：检测结果为负值在正常情况下不应出现，通常提示存在问题。可能原因包括：对照管吸光度高于测定管，可能因为样品中含有干扰物质；试剂空白设置不当；操作顺序错误；分光光度计调零不当等。

解决方法：检查操作步骤是否正确；确认对照管设置是否适当；检查分光光度计调零操作；如样品可能存在干扰物质，可采用其他方法进行验证或报告样品不适合测定。

问题五：不同批号试剂检测结果不一致

原因分析：不同批号试剂检测结果存在差异是实验室常见问题。可能原因包括：不同批号试剂之间存在批间差；试剂运输或保存条件不同；新批号试剂未进行验证或验证不充分等。

解决方法：新批号试剂使用前应进行验证，包括与原批号试剂的比对、质控品检测结果验证、标准曲线建立等。验证合格后方可使用。如发现批间差较大，应分析原因并采取措施。建立试剂批号管理记录，便于追溯。

问题六：ALT轻度升高但无明确病因

原因分析：临床中常见ALT轻度升高但患者无明显症状和明确病因的情况。可能原因包括：非酒精性脂肪肝，是常见原因之一；药物或保健品引起的肝损伤；饮酒导致的酒精性肝损伤；慢性病毒性肝炎的轻度活动期；代谢性疾病如糖尿病、高脂血症相关的肝损伤；剧烈运动后的一过性升高等。

解决方法：建议患者进行进一步检查，包括肝脏影像学检查（如B超）、病毒性肝炎标志物检测、血脂血糖检测等，必要时进行肝穿刺活检。同时详细询问病史，了解用药史、饮酒史、运动情况等。对于不明原因的ALT轻度升高，可定期复查，动态观察变化趋势。

• 检测前检查样品质量，避免溶血、脂血样品
• 定期校准仪器，确保波长和吸光度准确
• 严格控制反应温度和时间
• 建立完善的室内质控体系
• 新批号试剂使用前进行验证
• 加强操作人员培训，规范操作流程
• 建立完善的记录系统，便于问题追溯

综上所述，赖氏法丙氨酸转氨酶测定作为一种经典的肝功能检测方法，具有操作简便、设备要求低、结果可靠等优点，在临床诊断、健康体检、疾病监测等领域具有广泛的应用价值。正确掌握该方法的原理、操作步骤和注意事项，建立完善的质量控制体系，对于确保检测结果的准确性和可靠性至关重要。随着检验医学的不断发展，虽然出现了更多自动化、标准化的检测方法，但赖氏法仍然是许多实验室特别是基层医疗机构进行ALT检测的重要方法，在肝脏疾病的诊断和监测中发挥着重要作用。