CTLA4敲除小鼠模型

1、造模因素信息

小鼠CTLA4基因位于第一号染色体的1C2区段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

2、实验动物背景信息

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

3、研究背景

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表达在CD4 +和CD8 + T细胞的同源受体，两者共享在抗原呈递细胞表面表达的一对配体，并且在T细胞活化中介导相反的功能。配体与CD28相互作用，介导T细胞与T细胞受体（TCR）信号共刺激。CTLA4最初被发现是一种传递抑制信号，对于终止免疫反应非常重要[1, 2]。T细胞活化受到CTLA4的负面调节，例如与CD28竞争与它们共同的配体B7.1和B7.2的结合[3]。尽管CTLA4调节免疫系统的确切机制仍存在争议，但CTLA4的抑制功能受到广泛认可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴结和脾脏均显示大量淋巴细胞增殖，随后白细胞对几乎所有组织进行自身免疫攻击，并导致小鼠过早死亡[1, 2, 5]。

[1]Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.

[2]Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.

[3]Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.

[4]Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.

[5]Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.

3.1.4 模型构建流程

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立

3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立

（1）设计方案

一、载体构建

1.sgRNA 载体

载体名称：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctcaagg

m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatggaGg

m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体

sgRNA插入位点示意图

图1CTLA4敲除小鼠模型构建设计方案

构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion Am1354）

2，CAS9 载体

载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion Am1345）

显微注射：

1、超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。

2、受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3、雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。

4、受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5、胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。

基因型鉴定：

1、剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2、基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA

3、PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）

M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG

M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC

KO：

TM=62℃WT：727bp ko:(见测序分析)

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）

反应体系：

l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)

l2.0 μl

ldNTP Mixture(2.5 μM)

l1.6 μl

l引物-S（50μM ）

l0.2 μl

l引物-A（50μM ）

l0.2 μl

l模板DNA

l2.0 μl

lLA Taq

l0.2 μl

l补加ddH2O至总体积

l20.0μl

扩增程序：

l95℃

l15 min；

l95℃, 30 s

lTM-2℃, 30 s

l72℃, 2 min 30循环；

l72℃

lmin；

6×loading buffer 终止反应。

用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

4、结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）

1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR结果）

5、测序结果：

KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色为缺失部分

4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

7#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

10#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

15#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定

在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。

1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

（单样本）

Protease Plus

2 μL

Buffer L

100 μL

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

2.1. PCR反应体系：

PCR 反应组分

20 μL 反应体系 (μL)

50 μL 反应体系 (μL)

ddH2O

8

21

正向引物 (10 μM)

0.5

1

反向引物 (10 μM)

0.5

1

模板（消化产物）

1

2

2 x M-PCR OPTI™ Mix

10

25

注：模板体积可以适当调整。

2.2. PCR反应条件：

温度 (℃)

时间

循环数

94

5 min

1

94

20 sec

35

60

30 sec

72

X min (2kb/min)

72

5 min

1

12

--

1

试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子CTLA4 +/-,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲除小鼠CTLA4 -/-。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除杂合子小鼠；+/+：野生型小鼠。

4.2CTLA4敲除小鼠生存率及体重变化

早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠会在出生后1月内，由于严重的自身免疫疾病死亡。我们统计了小鼠出生后的生存率及体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（图3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多，但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠（图3b），体型也更小（图3c）。

图3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及体重变化

注：a：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生后8周内的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生4周内的体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后体重增长缓慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠体型对比。

4.3CTLA4敲除小鼠组织中蛋白表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4敲除，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图4）。

图4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表达

注：+/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠。

4.4敲除CTLA4基因可导致自身免疫疾病

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡，这与我们观察到的结果相似。HE染色结果显示，CTLA4敲除小鼠表现出淋巴样细胞向非淋巴组织（如心脏、肝脏）的浸润（图5b，d）。

图5组织中淋巴细胞浸润

注：在CTLA4-/-小鼠中，淋巴细胞广泛浸润到非淋巴组织中（b, d），图中显示的是心脏（a，b）和肝（c，d）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。