手足口病柯萨奇病毒A6型腹腔注射感染小鼠模型

一、疾病概述

手足口病是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。自1998年以来，已经成为世界范围内的重大公共卫生问题。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。

手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。此外，大部分肠道病毒在感染宿主机体时，主要由口腔进入消化道，在肠淋巴组织和感染者的咽部快速繁殖，随淋巴循环进入血液循环，之后侵入到肝、骨髓等处进行大量增殖并再次通过血循环，到达心脏、肺、肝脏等处，大量繁殖造成组织器官病变。

自2008年在芬兰的爆发以柯萨奇病毒A6型（Coxsackievirus A6, CA6）为主要病原的手足口病开始，CA6在世界范围的流行变得更为活跃，且出现了相应的重症病例。在法国、西班牙、美国、日本、泰国等国家都相继报道了CA6的手足口病流行事件，逐渐受到各国重视。2013年以前，中国多地区暴发流行的手足口病病原以EV71和CVA16为主，2013 年以后CA6 和CA10 相关的手足口病的比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体。在上海、西安、宁波、北京、吉林等地，2012-2013年的手足口病例中CA6所占比例已超过EV71和CA16，成为这些地区的主要致病原。在2017年，广东省爆发了CA6感染导致的大规模的手足口病流行，其中CA6的感染比例高达85.5%。类似的流行趋势也出现在中国其他地区，并呈现增长趋势。

与EV71和CA16相比，CA6引起的手足口病临床特征主要为发热、非典型性疱症和脱甲症。有研究表明，由CA6感染引起的HFMD患者中，脱甲症出现的几率高于EV71和CA16感染。手足口病通常发生在夏季和秋季，但由CA6引起的疾病有着冬季多发的特征。除手足口病之外，感染CA6还通常导致疱症性咽峡炎（HA），这种疾病会表现出口部出现疼痛性水疱的症状。CA6病毒具有五个分支（A-E），并具有两个亚系（E1、E2）。在2011年前，亚洲和欧洲地区D系、E1系和E2系毒株共存。自2008年以来，E2亚型已逐渐成为主要毒株，并导致手足口病爆发。

二、研究背景

1、CA6病毒信息

CA6病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属，病毒颗粒直径22～30nm，与EV71、CA16的形态相似，呈20面体，无囊膜﹐呈圆形颗粒状。病毒核心为病毒基因组，是单股正链RNA，全长约7000～8000bp。成熟的病毒颗粒外壳由32个壳粒组成，每个壳粒含有4种衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4，由病毒基因组的P1区编码，P2和P3区编码7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。四种结构蛋白中，VP4位于病毒颗粒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VP1～VP3暴露在病毒颗粒表面，包含了主要的抗原决定簇。

CA6病毒可在宿主细胞的胞浆内增殖，迅速引起细胞病变，表现为细胞皱缩、变圆脱落，最后病毒颗粒破膜释放。CA6病毒在RD细胞中的培养效果好，表现出典型的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。RD细胞感染病毒3天后，CA6的病毒载量可达到107TCID50/ml。

CA6的感染可以诱导机体产生特异性的抗体，具有中和作用，能够抵抗病毒的再次感染。在小鼠的实验中表明，用CA6病毒的中和性抗体可以清除病毒，使新生小鼠免受病毒感染导致的临床病症和死亡。此外，CA6病毒的中和性抗体还可通过母乳从母鼠传递给所生产的乳鼠，保证新生乳鼠免受病毒感染的侵害。CA6的感染后产生的特异性抗体与其他肠道病毒，如EV71、CA16，并没有明显的交叉免疫反应。

CA6感染引起的手足口病临床特点包括高热、咽痛、食欲下降等症状，其所引起的皮疹分布较为广泛，集中出现于上臂、大腿、臀部、口腔黏膜等部位；同时皮疹的皮损严重，甚至出现大疱疹、腐蚀性皮疹等表现；治愈后易留痂，脱甲现象比例更高；CA6一般不累及循环系统和神经系统，引起的重症或死亡病例的比例要比EV71及CA16小。

2、实验动物背景信息

ICR小鼠毛色白化，是国际通用的封闭群小鼠，适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好。雌鼠自发性畸胎瘤和管状腺瘤发病率为0%~1%，用氨基甲酸乙酯诱发时，11~16天胚胎期畸胎瘤和管状腺瘤发病率为5.9%，离乳个体管状腺瘤和囊瘤发生率为30%，孕鼠为3%。具有稳定的外周血项和骨髓细胞，是良好的血液学实验用动物。10日龄以内的ICR乳鼠对手足口病原较为敏感，乳鼠感染后常表现出衰弱、体重下降、后肢瘫痪、甚至死亡的症状，属于部分疾病动物模型，可用于手足口病原学、免疫学的研究，并应用于药物、疫苗的开发和应用。

3、研究背景

目前手足口病疾病动物模型主要是非人灵长类和小鼠动物模型，通过手足口病病毒感染模型研究手足口病的发病机制、治疗和预防手段。由于动物并给手足口病原的天然宿主，病毒的临床分离株需要在动物体内进行适应性培养，建立动物适应株方能感染动物，并引发临床症状。手足口病在婴幼儿中表现为发热，手、足、口腔等部位出现疱疹等症状，严重的并发症包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等神经系统相关疾病，以及中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎等。但动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，主要表现为体重下降、瘫痪和死亡。其中，现有的手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，表明手足口小鼠感染模型并非完全疾病模型，而属于部分疾病模型。由于手足口病病原谱的变化，CA6成为主要流行病原，因此本实验室建立并病鉴定了一种CA6感染的小鼠模型，用于研究病毒的感染机制和机体免疫反应，也可用于评价不同药物的抗病毒活性和疫苗的保护作用。

根据文献报道，厦门大学建立了新生乳鼠的CA6感染模型：对1日龄的Balb/c小鼠，使用100μl的毒株CA6/141病毒（105TCID50）通过腹腔或颅内注射方式进行感染，感染的小鼠出现了临床症状，如不活动、消瘦、后肢瘫痪，甚至死亡。采用实时RT-PCR方法检测CA6感染小鼠在感染后不同时间点不同组织中的病毒载量，发现：在感染后6小时，大多数器官中都能检测到CA6；在感染后的前24 h，脾脏和肝脏的病毒载量比其他组织增加得更快，提示脾和肝可能是CA6感染早期的靶器官；而在感染后72 h，肢体肌肉的病毒载量高达107copies/mg，同时大多数器官或组织中的病毒载量达到峰值，表明CA6已经感染了全身。大多数感染CA6的小鼠在感染96小时后死亡，存活率约20%。病理检查表明，CA6对骨骼肌和皮肤有特殊的趋向性，对神经系统和心肌无明显趋向性。感染CA6后，小鼠真皮出现小泡而无皮疹，CA6抗原主要集中在毛囊内。该小鼠模型被进一步应用于评估一种治疗性抗体和一种抗CA6的实验疫苗的有效性。（A neonatal mouse model for the evaluation of antibodies and vaccines against coxsackievirus A6. Antiviral Research, 2016, 134: 50-57.）

1.病毒准备：CA6病毒(购自ATCC，Gdula毒株，GenBank:AY421764.1)，病毒在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。

（1）细胞病毒培养操作：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA6病毒后，置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TICD50。

（2）组织病毒培养操作：

将CA6病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.实验动物：采用SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。CA6动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。

3.病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即2X105TCID50CA6病毒，将病毒经腹腔注射（i.p.）途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组注射同等量的PBS。

1.临床症状表型：

在临床表现及临床评分方面，7日龄小鼠在感染病毒后3 dpi开始出现精神萎靡、体重增加下降、后肢瘫痪等症状，最终全部死亡。感染CA6病毒的乳鼠均未出现皮肤出疹，在6 dpi时平均临床评分为4.7分（图1 A）。在体重变化方面，7日龄小鼠通过i.p.感染CA6病毒后约在3 dpi开始出现体重下降。经感染后的小鼠在6 dpi体重相对于对照组下降了3.3 mg（41.5%），在6 dpi感染组体重均显著低于阴性对照组（P < 0.05）（图1）。

2.血液和各组织中CA6病毒复制情况：

7日龄ICR小鼠经i.p.感染CA6后，血液中病毒载量在3dpi达到最高值，超过107copies/μl。肌肉组织中病毒载量呈现出随感染时间的增加而增多的趋势（图2 A），无论是在3 dpi还是5 dpi，肌肉中病毒载量均远高于其他组织，保持在108 copies/mg。而在其他组织中，病毒载量呈现出先增多后降低的趋势（图2 A、B）。

注：A：小鼠感染CA6病毒后血液和肌肉中病毒载量变化结果；B：小鼠感染CA6病毒后其他组织中病毒载量变化结果.

图 2. 腹腔注射感染7日龄ICR小鼠血液与各个组织病毒载量（每个时间点，n = 5）

3. 病理变化情况：

通过H&E染色对经腹腔注射感染CA6的7日龄小鼠的骨骼肌、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾、小肠、脑组织进行病理学检查，发现5dpi小鼠全身多脏器发生损伤和炎症反应。感染小鼠后肢肌肉出现了严重的病理改变，表现为炎细胞浸润、骨骼肌细胞变性坏死、间质水肿等（图3 F）。胸腺中出现胸腺皮质萎缩、淋巴细胞减少等病理改变（图3 G）。在小鼠的心脏组织中，出现了心肌水肿、空泡样变的病理损伤（图3 H）。小鼠脾脏出现髓外造血、白髓萎缩的病理改变（图3 I）。脑组织的病理结果显示，小鼠在感染5天后出现局部神经元周围和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤（图3 J）。其他组织并未见到明显病变。

综上所述，在感染CA6后，5dpi的病理观察中肌肉损伤最为严重，主要表现为炎症细胞浸润和骨骼肌细胞变性坏死。

（一）模型评价方法：

1. 临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染CA6病毒后观察13天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准对动物进行临床评分打分：

0分：未见异常；1分：驼背或炸毛；2分：后肢迟缓无力；3分：单后肢瘫痪；4分：双后肢瘫痪；5分：死亡。

2. CA6病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

2.1取样：分别在感染后第1天、第3天、第5天处死动物，采集血液100ul和后肢肌肉组织样本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和组织中的RNA；

2.3 一步法荧光定量PCR检测病毒核酸浓度：

（1）特异性引物和Taqman探针：

TCA6-F （GCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAA）

TCA6-R （CGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCC）

CA6-TaqProbe （FAM-CCATTACGACGCACCACCCCCTGGATTGA-BHQ）

（2）标准品：合成的CA6病毒核酸片段，以10倍稀释度设置8个稀释梯度， 109copies/μl—102copies/μl，每个浓度做3个重复。

（3）阴性对照和阳性对照：阴性对照用水代替核酸样本；阳性对照采用CA6病毒储液提取得到的核酸；

（4）荧光定量PCR试剂盒：QiagenRNeasyMiniKit（货号:74106），根据试剂盒要求准备反应体系；

（5）反应条件：①反转录：42℃，15min；②PCR过程：95℃ 15min；95℃ 15s，55℃ 55s，该步骤循环数为40；

（6）实验仪器：ABI Q3荧光定量PCR仪

（7）结果分析：①反应结果应符合阴性对照无扩增的条件，否则实验结果无效。②标准曲线：标准曲线R2大于0.95可用，若低于0.95数据不可用，则需重新测定；③结果判断：根据标准曲线计算出CA6病毒的载量。病毒载量的检测阈值为2X102copies/μl，低于该数值的结果不可信。

3.病理分析：HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

ICR小鼠腹腔注射感染CA6病毒5天后，取后肢骨骼肌、心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑置于10%福尔马林中固定72 h，经梯度酒精脱水后将其包埋在石蜡中，切片得到的石蜡切片厚度为 5 μm，随后进行H&E染色，最后在光学显微镜下观察组织病理变化。

（二）评价指标：

1.临床症状评价：根据临床评分标准，在灌胃感染CA6病毒观察期（13天）内，3dpi即可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；4dpi感染动物出现死亡，7dpi死亡率为100%。

2. 血液和组织中病毒复制情况评价体系：经腹腔感染CA6病毒后，1dpi血液和组织中病毒载量都低于检测阈值。CA6病毒首先在血液中复制达到较高水平，3dpi的检测值106~107copies/μl，而5dpi下降至105~106copies/μl；而在后肢肌肉组织中，CA6病毒载量自3dpi便保持高位，107~108copies/mg，说明病毒在肌肉中发生了大量扩增，具有典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上。

3. 病理评价体系：CA6病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润、间质水肿等。与后肢肌肉中高病毒载量、后肢瘫痪度临床症状相一致。除后肢肌肉外，在脾脏、胸腺、心脏和脑组织中也能观察到明显的病理变化，尤其是脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤，说明在小鼠CA6感染模型中也能出现神经性病变。

CA6病毒在人间传染病名录中属于第三类，涉及的实验需在BSL-2实验室进行，动物实验在ABSL-2实验室开展。CA6病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。

CA6病毒对5岁以下儿童易感，主要通过粪口传播，对于具有BSL-2防护装备的实验人员危害较小；实验人员均经过生物安全培训获得证书；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套，防护眼镜等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。

成年ICR小鼠对CA6病毒不敏感，21日龄ICR小鼠在感染大剂量病毒后仍能自愈。对于感染动物的排泄物进行检测，在少数粪便样本中检测到少量病毒，载量约为2X102~103copies/mg；因此需对垫料等接触动物粪便的物品按要求进行高压灭菌处理。

动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

采用7日龄ICR乳鼠、经腹腔注射CA6病毒的感染途径，成功获得CA6病毒腹腔感染小鼠模型。模型建立过程中采用临床评分标准对感染后动物的临床症状进行评价，并记录死亡率和体重情况；采用荧光定量PCR-标准曲线法对感染后动物血液和组织中的病毒载量进行测定，以确定病毒的复制情况；采用HE染色法对组织切片进行病理观察，确定组织病变情况。 本CA6病毒灌胃感染小鼠模型与文献报道的厦门大学的Balb/c乳鼠腹腔或颅内注射感染模型，虽然在小鼠品系、年龄，以及病毒毒株选择上各有不同，但都得到了具有典型病症的小鼠感染重症模型。小鼠感染CA6病毒的临床症状包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，最后所有动物都死亡。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉组织样本，检测到病毒载量从第1天的低水平上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），说明病毒在机体内的大量复制扩增；尤其是在肌肉组织中病毒载量的结果与临床症状相吻合。采集感染小鼠第5天心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，检测病毒载量在检测阈值之上，说明除了肌肉组织CA6病毒也能在其他组织中进行复制。 本模型与文献模型的不同之处在于：使用的病毒株不同，来自于不同病人的临床分离株；小鼠的日龄不同，我们使用7日龄的ICR乳鼠，相对于1日龄Balb/c乳鼠更易于感染实验的操作；感染途径不同，我们采用腹腔注射感染的方式，未采用颅内注射感染方式。在病理分析上，我们发现在感染CA6病毒的脾脏、胸腺和脑组织中观察到了相应病变；尤其脑组织中的病变与重症患者的脑炎症状接近。而在1日龄乳鼠上发现，CA6对骨骼肌和皮肤有特殊的趋向性，对神经系统和心肌无明显趋向性；感染CA6后，小鼠真皮出现小泡而无皮疹，CA6抗原主要集中在毛囊内。 CA6病毒灌胃感染模型的建立需要确定乳鼠的日龄和感染的剂量。由于CA6病毒对5岁以下儿童易感，相应的CA6病毒也只能使乳鼠在感染后表现出症状。我们试验了7日龄和10日龄的乳鼠，发现10日龄乳鼠感染后症状表现不稳定，因此选取了7日龄乳鼠作为感染动物。对于病毒感染剂量，我们也尝试了106、107、108 TCID50，选择了症状更为合适和稳定的107 TCID50。