氯化钙-乙酰胆碱混合液诱导小鼠心房颤动模型

一、疾病概述

心房颤动（Atrial Fibrillation）是一种目前人类最常见的心律失常，特点是心房无序除极导致心房无有效收缩，有较高的发病率和死亡率，且随年龄增长，房颤发病率明显增加，随之出现的房颤相关的临床并发症如心力衰竭、卒中等血栓栓塞事件的发生率亦明显提升。针对房颤的治疗基于病因学、室率控制、预防复发及预防血栓栓塞四个方面。目前认为房颤病理机制是进行性的，因此大多数患者是从阵发性房颤进展为持续性房颤和长程持续性房颤。2014年美国心脏协会/美国心律协会将房颤分为4类：阵发性房颤（发作7天自行/经干预终止）、持续性房颤（发作7天内不能自行终止）、长期持续性房颤（持续超过12个月）、永久性房颤（房颤持续且患者和医生共同决定不再继续控制心律治疗）。随着病情进展，长程持续性房颤的治疗失败率及复发率均较高，约20-60%的患者在接受射频消融或电转复治疗3个月内出现房颤复发。

目前认为，房颤治疗失败与心肌结构重构密切相关，进而损害了心房心肌细胞的电传导和收缩功能。纤维化的发展可形成房颤基质，破坏传导，促进房颤的维持和进展。目前越来越多的研究致力于揭示房颤传导的心肌细胞结构重构、电重构、收缩重构的分子机制，努力开发基于机制的房颤治疗。因此需要对房颤有更好的生物学了解，才能引领新的治疗途径。自然界中，自发房颤在大多数物种中几乎不存在，所以研制房颤动物模型对于房颤发生发展过程的深入研究及其治疗起到了至关重要的作用。

二、模型背景

1、造模因素信息

氯化钙-乙酰胆碱混合液诱导小鼠心房颤动模型

2、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

大多数物种几乎不存在自发性心房颤动，因此诱发模型成为房颤模型研究的重点，以往针对房颤的机制研究主要以大动物的房颤模型为多见，但造模模过程操作复杂、费用高，且样本量少、个体差异较大导致研究可信度下降。因此，随着科研人员对小鼠房颤模型的诸多探索，越来越多的研究者在此基础上进行相关的机制及药物研发实验。

当前诱发小鼠房颤模型的类型有：1.电刺激房颤模型：小鼠快速起搏器模型制备，将小鼠麻醉后经颈静脉置入心房电极，予频率刺激或同时给予胆碱能神经兴奋剂可成功诱发房颤[1]。2.迷走神经刺激房颤模型：小鼠经麻醉后将刺激电极置于食管内进行心房频率起搏电刺激可成功诱发房颤[2]。3.基因工程房颤模型：自发性房颤模型需要基因操作，但多存在严重的心功能障碍、心房重构和寿命缩短等问题[3,4]。4药物诱导房颤模型：常用的药物诱发房颤模型多选择乙酰胆碱药物诱发，乙酰胆碱缩短心房的有效不应期有利于房颤折返的形成，降低房颤发生的条件[5]；且乙酰胆碱可使窦房结自律性降低，异位起搏点自律性相对上升，进而解除了窦房结对异位兴奋的抑制，增加房颤发生的可能[6,7,8]，综上，选用药物诱导的方法，操作简单，无需复杂仪器，可以根据动物发病情况及时调整药物的剂量。

参考文献:

1.Wakimoto H,Maguire CT, Kovoor P, et al. Introduction of atrial tavhycardia and fibrillation in the mouse heart[J]. Cardiovasc Res,2001,50(3):463-473.

2.Guo X ,Yuan S,Ｌiu Z, et al. Ｏxidation -and CaMKII-mediated sarcoplasmic reticulum Ca(2+)leak triggers atrial fibrillation in aging[J]. J Cardiovasc Electrophysiol,2014,25(6):645-652.

3.Ozcan C, Battaglia E, Young R, Suzuki G. LKB1 knockout mouse develops spontaneous atrial fibrillation and provides mechanistic insights into human disease process[J]. J Am Heart Assoc. 2015;4:e001733.

4.Müller FU, Lewin G, Baba HA, Bokník P, Fabritz L, Kirchhefer U, Kirchhof P, Loser K, Matus M, Neumann J, et al. Heart-directed expression of a human cardiac isoform of cAMP-response element modulator in transgenic mice[J]. J Biol Chem. 2005;280:6906–6914.

5.Seemann G,Bustamante PC,Ponto S,et al. Atrial fibrillation-based electrial remodeling in a computer model of the human atrium[C]//Computing in Cardiology,Belfast,UK,2010:417-420.

6.Juhász Ｖ,HornyikT,Benák Ａ,et al. Comparison of the effects of IK,ACh,IKr and INa block in conscious dogswith atrial fibrillation and on action potentials in remodeled atrial trabeculae[J].Can J physiol Pharmacol,2018,96(1):18-25.

7.Yang Q,Wu G,Han L,et al.Taurine Reverses Atrial Structural Remodeling inAch-Cacl2 Induced Atrial Fibrillation Rats[J].Adv Exp Med Biol, 2017;975 Pt 2:831-841.

8.曾财武,刘权,陈鹏飞,等. 昆明小鼠心房颤动模型的建立[Ｊ]. 心肺血管病杂志,2017,36（6）：488-492

1 实验材料

实验动物 健康成年C57小鼠，10只，体重20-30g，均购于北京华阜康华生物科技股份有限公司。饲养于中国医学科学院实验动物研究所动物中心动物房的屏障系统内，5只/盒，温度( 22±2) ℃，湿度50%～60%，12 h 循环照明，小鼠自由摄取食、水。

2 方法

2.1 动物模型制备

随机分为房颤组和对照组，小鼠称重后经2%异氟烷气体麻醉后，连接MP150多导生理仪生理仪电极，记录小鼠心电图，待心电图稳定后经小鼠尾静脉注射CaCl2(5mg/ml)-Ach(25ug/ml)混合溶液，用量为0.1ml/10g，现用现配，5s内注射完，生理仪持续记录给药前后的小鼠心电图，清晰的显示出心房颤动诱发情况，每次给药间隔24小时，连续给药10天。

2.2 小鼠心房颤动定义

多导生理仪记录肢体II导联心电图，P波消失，代之以大小不等f波并持续时间>2s为心房颤动发生，f波消失P波出现即定义为心房颤动终止。

2.3标本采集及处理

完成最后一天的尾静脉注射后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2 h后于4℃ 3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取部分心脏10%中性福尔马林中固定，做石蜡切片，HE染色、马松染色和天狼星红染色分析；部分小鼠心脏组织液氮冷冻-80℃保存，提取双侧心耳蛋白进行免疫印迹检测。

1.小鼠尾静脉注射CaCl2(5mg/ml)-Ach(25ug/ml)混合溶液前后心房颤动心电图表现

2.心房心肌纤维化评估

3.诱导小鼠心脏功能检测

4.病理评估

动物模型制备过程中，由饲养人员进行日常饲喂，由兽医进行监督管理，造模期间动物状态良好，每天记录病死只数，造模选用CaCl2(5mg/ml)-Ach(25ug/ml)混合溶液经尾静脉注射，对动物伤害小，每周称重一次，未使用微生物，对环境没有影响，造模方法简便易行，重复性好，不可遗传。另外，由于该药物可以诱发心脏骤停进而引起动物死亡，因此在注射时需要注意推进速度。

人类心房颤动的诊断需以心电图为主要依据，心电图诊断标准为P波小时消失，f波代之，频率300-600次/min，QRS波节律绝对不规则，表现为RR间期不匀齐，QRS波形态多正常。因大多数物种中几乎不存在自发性心房颤动，故综合多数研究定义动物模型心电图诊断标准为：生物技能系统记录多导生理仪记录肢体II导联心电图，P波消失，代之以大小不等f波并持续时间>2s为心房颤动发生，f波消失P波出现即定义为心房颤动终止。

模型的评判：小鼠经尾静脉注射静脉注射CaCl_{2(5mg/ml)-Ach(25ug/ml)混合溶液诱导后，生理仪记录肢体II导联心电图显示，P波消失，代之以大小不等f波，并持续时间>2s， 可以为成功诱导房颤的发生。}

CaCl2(5mg/ml)-Ach(25ug/ml)混合溶液经尾静脉注射小鼠，可以成功诱导小鼠发生，心房颤动心律失常，该方法模型为阵发性心房颤动模型，MMP9心脏纤维蛋白表达增加，心脏功能未发生明显改变，病理结果显示未发生显著的纤维化改变，可以应用于阵发性心房颤动的发病机制研究及治疗药物的筛选。该模型操作简单，对注射时间有一定的限制。