丙型肝炎病毒感染人源化小鼠模型

丙型肝炎主要病因是丙型肝炎病毒感染引起，HCV感染极易慢性化，HCV感染与肝癌的发生有密切关系。HCV的致病机制与病毒的直接致病作用和免疫病理损伤有关，包括HCV干扰细胞内大分子合成等的直接杀伤作用、HCV特异性CD8和CD4 T细胞免疫应答、宿主自身免疫因素的参与以及细胞凋亡。 HCV主要传染源是急慢性患者和无症状病毒携带者，通过肠道外途径如血制品、注射、密切接触等传播，人类普遍对HCV易感，目前尚无疫苗。 丙型肝炎临床表现为急性肝炎包括急性黄疸型肝炎和急性无黄疸型肝炎；超过半年或原有肝炎急性发作后再次出现肝炎症状、体征和肝功能异常者发展为慢性肝炎，严重者在多种复杂因素下进展为重型肝炎。根据临床表现的严重程度，亚急性重型肝炎和慢加急性重型肝炎可分为早、中、晚期。除此之外，肝炎还表现为淤疸型肝炎、肝炎肝硬化。可发生严重并发症如肝性脑病、上消化道出血、肝肾综合征和感染。

往往通过有无输血及血制品、静脉吸毒、血液透析多个性伴侣、不洁注射及纹身等病史，以及相应肝功能临床诊断，和有无HCV抗体IgM或IgG、HCV RNA阳性进行诊断。

1、CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体基因和STAT1基因信息

CD81(gen ID：975)、CLDN1(genID：9076)、OCLN(gen ID：100506658)、SRB1(genID：949)、STAT1（genID：6772）从GenBank数据库上获得。

2、实验动物背景信息

实验动物选择远交系ICR品系，是1973年从日本国立肿瘤研究所引进。购于北京维通达生物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。此鼠温顺，生育能力高。

3、研究背景

丙型肝炎病毒（HCV）是经血液传播病毒，感染人类后易慢性化。病毒的持续存在可使肝炎向肝脂肪病变、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌进展，严重威胁人类健康。在世界范围，据估计，2015年病毒性丙型肝炎的患病率为1.0%（95%的不确定区间为0.8-1.1），有7100万（62.5-79.4）为慢性病毒性感染。目前尚无HCV疫苗，而疫苗研发难点除了HCV基因组差异大，不同基因型的病毒序列差异可高达50%{Bukh, 1995 #111}{Simmonds, 2005 #112}，在感染机体内常以准种形式存在外，目前缺乏合适的动物模型也限制了HCV疫苗的研发应用。

HCV自然宿主是人和黑猩猩，由于灵长类动物费用高和伦理问题复杂，限制了该类动物的应用。近几年，国内外学者已经在小型动物模型上进行各种尝试，已取得部分进展，主要有：

（1）树鼩模型：树鼩对HCV易感，一些动物在初次感染3年后疾病可进展成肝纤维化和肝硬化{Amako,2010 #155}。但树鼩属于野生动物，遗传品系不稳定，应用受限。

（2）HCV基因转基因小鼠模型：可表达表达HCV基因单个蛋白组分产物或基因多个蛋白组合产物，但会由于表达HCV产物的不同、小鼠背景的差异性或HCV蛋白表达所用启动子不同而出现组织病理报告差异大，表现为不同程度的肝疾病，使针对发病机制研究时需要多加注意。

（3）异种移植小鼠模型：通过将人肝细胞（如肝癌细胞系或者原代肝细胞）移植入小鼠体内，形成人肝移植小鼠。该类小鼠模型免疫缺陷，不能用于研究宿主抗HCV的特异性适应性免疫反应和再现病毒整个生命周期。

（4）宿主因子人源化小鼠模型：在HCV感染人体过程中有四个（CD81、SCARB1、CLDN1和OCLN）入侵必需宿主因子，其中CD81第二个包外环关键氨基酸残基和OCLN分子是阻止HCV入侵啮齿动物细胞的原因。利用腺病毒瞬时表达人CD81单分子或同时表达人CD81、SCARB1、OCLN和CLDN1四种分子的小鼠模型却并未成功建立HCV感染{Masciopinto, 2002#191}{Hikosaka, 2011 #192}。在近交鼠上同时稳定表达人CD81和OCLN分子能使HCV成功入侵，但小鼠的免疫系统限制了HCV的感染{Dorner, 2011 #194}，在此基础上敲除STAT1-/-，该小鼠能成功建立HCV感染，并能激活适应性免疫反应。

为解决现有丙型肝炎病毒感染小鼠模型缺乏，目的在于提供了一种构建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并STAT1基因敲除小鼠模型，用于HCV感染动物模型和HCV疫苗探索研究的模型基础。

除非特别说明，本发明采用的试剂、设备仪器为本技术领域常用试剂盒仪器，均可从商业途径得到。pFUW-CSCO-4hEF载体质粒是王天翼研究员惠赠，见图1所示

1） CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因ICR小鼠构建（北京维通达生物技术有限公司）

pFUW-CSCO-4hEF载体质粒经过NdeI内切酶（NEB， #R0111V；Cutsmart buffer： NEB， #B7204S）消化，得到线性DNA片段；将线性化DNA片段经显微注射入ICR小鼠受精卵，移入假孕小鼠子宫内；小鼠出生后，提取基因组，采用跨启动子区域设计特异性引物Primer1，检测筛选得到的阳性F0小鼠（PCR产物片段为872bp），再用Primer2对插入的目的基因进行检测鉴定（PCR产物片段1643bp），获得CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因ICR子代小鼠（简称4hEFTg）；

PCR特异性引物序列如下：

Primer1：

F：5’CGGAACAGGCGAGGAAAAGT

R：5’ACAAAACACACTCGCCAACC

Primer2：

F：5’ CCTGTCATCTGCCAAATCCG

R：5’ TACTGATCCACGTAGAGTCCA

PCR反应体系：

PCR程序：

2）构建纯合STAT1-/-小鼠模型（北京华阜康生物科技股份有限公司）

针对STAT1基因第一外显子和第二外显子序列，设计2对sgRNA序列，通过构建STAT1基因敲除载体并体外转录获得sgRNA

在NCBI上查询小鼠STAT1基因信息，根据靶点序列和脱靶位点、发生错配可能性大小进行设计和评估筛选，核苷酸序列和由公司（上海英潍捷基）合成的sgRNA序列如下所示；

位点1：actccaagttcctggagc agG

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up1 5’ATGGactccaagttcctggagc

m-STAT1-grna-down1 5’AAACGCTCCAGGAACTTGGAGT

位点2：cct cctctcacagctggacga

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up2 5’ATGGTCGTCCAGCTGTGAGAGG

m-STAT1-grna-down2 5’AAACcctctcacagctggacga

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的pUC57-sgRNA载体，通过体外转录成为可注射的sgRNA（体外转录试剂盒：Ambion Am1354）。

pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录试剂盒：AmbionAm1345）。

经显微注射入ICR小鼠受精卵；

受精卵移植入ICR假孕雌鼠子宫；

小鼠出生7-10天后，剪取脚趾和尾尖，提基因组DNA（全式金Transgen公司的基因组DNA提取试剂盒 EE101-12），根据STAT1基因序列信息设计PCR检测引物（上海英潍捷基），经PCR方法检测敲除基因型，得到阳性F0代小鼠（STAT1+/-）;

PCR检测引物：

m-STAT1-ko-S 5’gagagtaatttaatggttgggctc

m-STAT1-ko-A 5’CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAAC

TM=63℃

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRaRR042A）

反应体系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)

2.0 μl

dNTP Mixture(2.5 μM)

1.6 μl

引物-S（50 μM ）

0.2 μl

引物-A（50 μM ）

0.2 μl

模板DNA

2.0 μl

LA Taq

0.2 μl

补加ddH2O至总体积

20.0μl

扩增程序：

6×loadingbuffer 终止反应。

用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

鉴定结果如图2所示，鉴定出两种条带型，选取检测分子量不同于野生型条带的目的条带进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。即获得的小鼠为杂合子STAT1+/-小鼠（WT条带大小：1081bp）；

F0代小鼠经自交，出生小鼠经基因组PCR方法鉴定，获得纯合STAT1-/-小鼠。

3）构建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并STAT1基因敲除ICR小鼠动物模型

将纯合STAT1-/-小鼠与4hEFTg小鼠杂交，出生小鼠经PCR方法检测STAT1基因敲除情况和四受体基因表达情况（PCR检测引物见上述构建方法），获得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因阳性STAT1杂合敲除的F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠；

F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠自交，出生小鼠经PCR扩增测序检测，鉴定STAT1基因敲除情况和四受体基因表达情况（PCR检测引物见上述构建方法），得到基因型，获得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因阳性合并STAT1纯合敲除的F2代4hEFTg STAT1-/-小鼠，即为小鼠动物模型。

4）利用4hEFTg STAT1-/-小鼠进行HCV感染评价

丙型肝炎病毒JFH1通过尾静脉注射（1x10^7FFU）感染4hEFTg STAT1-/-小鼠，感染3月后取小鼠肝组织。用qRT-PCR方法（QIAGEN 210210）检测肝细胞中的HCV RNA，1%DNA胶鉴定产物结果。相对于野生型ICR小鼠组，4hEFTg STAT1-/-小鼠组能检测到HCV RNA，显示4hEFTgSTAT1-/-小鼠能成功感染HCV。

模型构建与检测数据如下：

对该动物模型进行HCV感染验证：尾静脉注射HCV三个月后，对HCV RNA通过RT-PCR方法进行验证：

动物模型制备过程中的监督管理、处置措施、微生物菌株管理、细胞系描述、遗传分析、对环境和生态影响的评估均符合相关规定。

该动物模型主要是通过显微注射法完成模型制备，再运用基因组PCR方法对相关转基因和敲除基因进行鉴定和分析。

之前的HCV感染模型主要基于黑猩猩；由于小鼠易繁殖，基因操作性强，虽然HCV在小鼠上感染困难，但基于先进的基因组操作技术，近几年来，转基因小鼠成为HCV模型研究热点。主要有转基因模型、异种移植小鼠。后者主要是通过将人肝细胞（如肝癌细胞系或者原代肝细胞）移植入小鼠体内，形成人肝移植小鼠；该类免疫机能缺失小鼠模型不能用于研究宿主对HCV的特异性适应性免疫反应和再现病毒整个生命周期。前者通过表达HCV基因单个蛋白组分产物或基因多个蛋白组合产物模型和表达人宿主分子或失活小鼠抑制性分子构建小鼠模型（人源化模型）。有研究通过瞬时表达HCV四受体分子于小鼠上却并未取得成功感染，在此基础上同时稳定表达人CD81和OCLN分子的近交鼠能使HCV成功感染{Giang, 2012 #193}{Dorner,2011 #194}。

该模型继承了之前小鼠模型的方便繁殖等优点，在前人基础上运用转基因技术和CRISPER/Cas9技术敲除相关基因，能提供HCV入侵受体的同时，敲除了STAT1能使天然免疫应答受限但并未缺陷小鼠的适应性应答，更加利于HCV在小鼠体内长期感染，用于HCV慢性感染研究，为疫苗探索提供模型基础。