内毒素血症IL-1R8基因敲除小鼠模型

一、疾病概述

内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起的一种病理生理表现。内毒素血症分为内源性和外源性两大类。内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克等。

二、模型背景

1、小鼠IL-1R8基因信息

IL-1R8基因位于小鼠7号染色体，又称Sigirr（single immunoglobulin and toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain）。属于白介素1受体家族。

2、实验动物背景信息

C57BL/6J

3、研究背景

目前对于IL-37a的研究并不深入，作为一种新型炎症抑制因子其可能与IL-37b具有相近的功能与作用机制，IL-1R8已被证明为IL-37b的受体，我们的研究证明IL-1R8也是IL-37a的受体。IL-1R8基因敲除小鼠模型能够广泛应用于IL-37a参与调控的各种免疫或炎性症疾病的研究。

参考文献：

[1] 李梦媛，韦荣飞，杨星九等.全长与成熟形式IL⁃37b的真核表达载体的构建与研究[J].中国比较医学杂志,2018,28（2）:59-63.

[2] 李梦媛，燕正强，韦荣飞等.IL⁃37b通过抑制树突状细胞相关的免疫应答缓解感染性休克[J].中国比较医学杂志，2017,27(11)44-49.

[3] 李梦媛，韦荣飞，徐大模等.人IL⁃37b在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性鉴定[J].中国比较医学杂志，2017，27（3）:20-24.

[4] 李梦媛，杨星九，徐大模等.IL-37对炎症相关性疾病的抑制作用[J].中国比较医学杂志，2015，25（12）:75-80.

[5] Nold-Petry CA et al. IL-37requires the receptors IL-18Rα and IL-1R8 (SIGIRR) to carry out itsmultifaceted anti-inflammatory program upon innate signal transduction. NatImmunol. 2015, 16(4):354-65.

1、实验材料

（1）实验动物

本模型构建用到的小鼠均来自于本研究所遗传中心。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为GR18001。

（2）实验仪器

（3）试剂

2、模型构建环境

中国医学科学院医学实验动物研究所SPF级动物房。

3、模型构建方法

1）构建策略

CRISPR/Cas9构建方法。

2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1：

M-SIGIRR-gRNA-UP15’TAGGCTGTTGTACTCTTTCTGC

M-SIGIRR-gRNA-DOWN15’AAACGCAGAAAGAGTACAACAG

靶点2：

m-SIGIRR-grna-up25’taGGcttctggtaagaaggcatcc

m-SIGIRR-grna-down25’AAACGGATGCCTTCTTACCAGAAG

3）合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

4）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

5）显微注射

（1）超数排卵：15只3-4周龄C57BL/6J鼠注射激素进行超排。

（2）受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

（3）雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的C57BL/6J鼠。

（4）受体鼠制备：8-10周龄C57BL/6J鼠与结扎的C57BL/6J鼠交配后选取见栓的雌鼠。

（5）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

6）基因型鉴定

（1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

（2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

（3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

7）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

1、基因型鉴定

2、基因表达

qPCR检测IL-1R8基因敲除小鼠脾脏中IL-1R8 mRNA的表达。

3、表型特征

内毒素血症

IL-1R8基因敲除小鼠在LPS诱导的致死性休克疾病中，与野生型小鼠相比较，死亡率更高。检测其血清中相关促炎性细胞因子的表达，结果显示，IL-1R8小鼠产生的促炎性细胞因子的表达水平更高，与其高致死率的表型相符。

本模型于中国医学科学院医学实验动物研究所动物房构建，由遗传中心技术人员进行相关操作，制备过程中的监督管理、处置措施、微生物菌株管理、细胞系描述、遗传分析、对环境和生态影响的评估等均严格按照研究所关于动物资源制备的相关规定或措施开展。

目前对于IL-37a的研究并不深入，作为一种新型炎症抑制因子其可能与IL-37b具有相近的功能与作用机制，IL-1R8具有显著抑制炎症反应的功能，已被证明为IL-37b的受体，我们的研究证明IL-1R8也是IL-37a的受体。IL-1R8基因敲除小鼠模型能够广泛应用于IL-37a参与调控的各种免疫或炎性症疾病的研究。

目前对于IL-37a的研究并不深入，作为一种新型炎症抑制因子其可能与IL-37b具有相近的功能与作用机制，IL-1R8具有显著抑制炎症反应的功能，已被证明为IL-37b的受体，我们的研究证明IL-1R8也是IL-37a的受体。IL-1R8基因敲除小鼠模型能够广泛应用于IL-37a参与调控的各种免疫或炎性症疾病的研究。