柯萨奇病毒A10型灌胃感染小鼠模型

一、疾病概述

手足口病是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。自2008年在新加坡的暴发流行，柯萨奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成为手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆发事件在法国、芬兰、印度等国家和地区不断被报道。在我国，2013年以前主要流行的手足口病病原以EV71和CA16为主，CA6和CA10次之；而在2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体之一。CA10共分为A～G的7个基因型，可根据各地流行株的序列信息进行核苷酸和氨基酸的同源性对比，从而分析CA10的流行情况。在我国，CA10近年来在多地区流行的病毒株保持着较高的同源性，与其他国家的分离株之间的同源性距离较远，具有地域分布特点以及一定的时间分布特点。CA10传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，在短时间内可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。

CVA10属于小RNA病毒科肠道病毒属，病毒直径约30nm，衣壳包裹着单股正链RNA，无囊膜，呈正二十面体结构。CA10病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。目前有大量研究表明，手足口病患儿的细胞免疫出现紊乱，并且这种免疫紊乱在重症与死亡病例中表现得更加严重。肺水肿被认为是感染的患儿中是最为严重的并发症之一，脑干的损伤则被认为是导致肺水肿的重要因素。很多研究表明参与细胞免疫的诸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T细胞亚群CD3+CD4+，以及自然杀伤细胞（NK）等，与肺水肿的发生具有相关性。

CA10易感染5岁以下年龄的幼儿，潜伏期多为2-10天。CA10感染儿童多引起轻型手足口病、疱疹性咽峡炎等，患儿往往无明显的早期症状，大多数病人预后良好。临床上，往往表现为多发的斑丘疹和（或）疱疹，最多见于手足口、臂及膝关节。典型疱疹通常突出皮肤表面，呈现黄豆粒大小，圆形或椭圆形，其内液体混浊，常无疼痛和瘙痒感，约1周时间疱疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有发热、流涕、咳嗽、食欲不振、恶心、呕吐或腹泻等症状，一般能自愈，无后遗症。但少数儿童感染CA10后出现严重并发症，如脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和神经呼吸综合征等。

由于CA10病毒主要通过粪口传播，在自然感染状态下是经胃肠道侵入机体的，因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA10小鼠腹腔注射感染模型的基础上，继续研究了通过灌胃方式建立的小鼠感染模型，为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础，也可用于药物和疫苗开发和验证实验。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，是柯萨奇病毒A组成员，病毒呈对称二十面球体结构，无囊膜，由蛋白外壳和核酸组成，其核酸为单股正链RNA。CA10病毒基因组为单股正链RNA，全长约7.4 kb。CA10基因组两端为保守的非编码区，中间为一个独立连续的开放阅读框架（ORF）。基因组的顺序依次为5'端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3'端非编码区。5’端共价结合小分子蛋白质Vpg（约7kDa），与病毒RNA合成和基因组装配有关；3’端带有polyA尾。P1 区编码4 种衣壳蛋白VP1 ~VP4，VP1 ~ VP3 在病毒表面，VP4 包裹在感染病毒的内部，这4种衣壳蛋白均具有抗原活性；P2 和P3 区编码7 种非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D，与病毒RNA 的复制、转录，病毒多聚蛋白的剪切、病毒颗粒的装配等功能相关。CA10病毒可在RD细胞中培养，培养温度为 37℃，48~96h达到复制高峰；病毒在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变，表现为细胞皱缩、变圆脱落，最后病毒颗粒破膜释放。CA10病毒的感染可以诱导机体产生高滴度的抗体，具有中和作用，能够抵抗病毒的再次感染。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体之一。

2、实验动物背景信息

ICR小鼠毛色白化。适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好，雌鼠自发性畸胎瘤和管状腺瘤发病率为0%~1%，用氨基甲酸乙酯诱发时，11~16天胚胎期畸胎瘤和管状腺瘤发病率为5.9%，离乳个体管状腺瘤和囊瘤发生率为30%，孕鼠为3%。是国际通用的封闭群小鼠。外周血项和骨髓细胞，具有较好的稳定性，是良好的血液学实验用动物。10日龄以内的ICR乳鼠对手足口病原较为敏感，由于CA10病毒具有嗜肌性，乳鼠感染后常表现出竖毛、单肢瘫痪、双肢瘫痪、甚至死亡的病症，是进行是手足口病原研究的理想动物。

3、研究背景

随着CA10流行程度的增加、重症病例的出现，开发针对性的抗病毒药物和疫苗成为当务之急；肌肉注射感染和腹腔注射途径的感染与CA10病毒粪口传播的自然感染方式存在一定的差距，因此有必要建立稳定的CA10病毒灌胃感染动物模型，不仅可以用于研究病毒自然感染机制和机体免疫反应，也补充了药物和疫苗研发和验证的关键模型。

目前国内的CA10病毒动物感染模型有泰山医学院的史卫峰教授课题组的ICR乳鼠感染模型，采用5日龄ICR乳鼠感染CA10细胞适应株TA151R，感染剂量为1.5X103TCID50，感染途径为肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。

本课题组已建立的CA10病毒动物感染模型采用腹腔注射途径，对7日龄ICR乳鼠感染104 TCID50 CA10病毒。感染4天后，感染小鼠的临床症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠临床症状评分超过4分；感染后第7天，感染小鼠全部死亡。同时，相对于正常组小鼠，感染小鼠体重增加减缓。检测感染小鼠血液和后肢肌肉中病毒载量发现：第3天血液中病毒载量到达高水平1.7X107 copies/μl，随后下降至1.1X105copies/μl；后肢肌肉的病毒载量在第3天和第5天都维持很高的水平，分别为2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。

1.病毒准备：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由医院咽拭子分离得到，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。

（1）细胞病毒培养操作：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA10病毒后，置于37℃ 5%CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TICD50。

（2）组织病毒培养操作：

将CA10病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.实验动物：采用SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。CA10动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。

3.病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即107 TCID50 CA10病毒，将病毒经灌胃途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。

1. 临床症状表型：

7日龄ICR小鼠感染CA10病毒5天后，开始出现不同程度的临床症状，症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。第7天感染小鼠出现死亡，此后临床症状评分持续升高，持续出现小鼠死亡现象。到观察期结束（感染后12天）时平均临床评分为4分，存活率为20%（图1A，1B）。不过，感染小鼠体重增加未出现显著减缓，尤其是前10天基本与正常小鼠一致（图1C）。

图1. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA10病毒后症状观察。A，感染后乳鼠的存活率时间变化曲线； B，感染后乳鼠的临床症状评分时间变化曲线； C，感染后乳鼠体重随时间变化曲线。

2. 血液和组织中病毒复制情况：

感染后第1天血液和肌肉组织中病毒载量都低于检测阈值。到第3天血液中病毒载量均值达到4.6 X 106 copies/μl，第5天时则下降至4X105copies/μl（图2A）。后肢肌肉的病毒载量在感染后第3天为1.9X107 copies/mg，第5天继续上升至1.1X108 copies/mg（图2B）。除肌肉组织外，在其他组织样本中也都能检测到CA10病毒RNA，其中肝脏中的病毒载量最高，最高值可达105 copies/mg（图2C）。心脏、肾脏、小肠和大脑中的病毒载量都超过了104 copies/mg；脾脏、肺和胸腺病毒复制比较少，都低于104 copies/mg。

图2. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA10病毒后血液和组织中病毒载量情况。A，感染后第3天和第5天血液中病毒载量情况； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉组织中病毒载量情况；C，感染后第5天心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺和脑组织中病毒载量情况。

3. 病理变化情况：

CA10病毒具有明显的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒载量最高，且感染后的临床症状也表现为后肢的瘫痪症状，病理结果分析发现：骨骼肌病理损伤严重，具体表现为骨骼肌细胞变性坏死、大量炎细胞浸润（图3A）。除后肢肌肉外，在脾脏、胸腺和脑组织中也能观察到明显的病理变化：脾脏中能观察到白髓萎缩，伴有巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞形成的星空现象（图3B）；胸腺组织切片出现皮质变薄，淋巴细胞凋亡及坏死等病理损伤（图3C）；脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象（图3D）。其他组织，包括心脏、肝脏、肺、肾、小肠组织均未见明显病理损伤。

图3. ICR7日龄乳鼠感染CA10病毒后组织病理变化情况。A-D，感染后第5天后肢骨骼肌、脾脏、胸腺、脑组织病理切片情况； E-H，正常小鼠的后肢骨骼肌、脾脏、胸腺、脑组织正常对照。（HE染色，A&E标尺=100μm，B-D&F-H标尺=200μm）

（一）模型评价方法：

1. 临床症状观察：

动物感染CA10病毒后观察10天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分：

0：未见异常；

1：驼背或炸毛；

2：后肢迟缓无力；

3：单后肢瘫痪；

4：双后肢瘫痪；

5：死亡。

2. CA10病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

2.1取样：分别在感染后第1天、第3天、第5天处死动物，采集血液100ul和后肢肌肉组织样本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和组织中的RNA；

2.3 一步法荧光定量PCR检测病毒核酸浓度：

（1）特异性引物和Taqman探针：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）标准品：合成的CA10病毒核酸片段，浓度梯度为：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8个稀释梯度，每个浓度做3个重复。

（3）阴性对照和阳性对照：阴性对照用水代替核酸样本；阳性对照采用CA10病毒储液提取得到的核酸；

（4）荧光定量PCR试剂盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（货号:74106），根据试剂盒要求准备反应体系；

（5）反应条件：①反转过程：50℃ 30min；②PCR过程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，该步骤循环数为40；

（6）实验仪器：ABI Q3荧光定量PCR仪

（7）结果分析：①反应结果应同时符合以下条件，否则实验结果无效。

阴性对照：无扩增，为阴性。

②标准曲线：标准曲线R2大于0.95可用，若低于0.95数据不可用，则需重新测定；

③结果判断：根据标准曲线计算出CA10病毒的载量。病毒载量的检测阈值为2X102 copies/μl，低于该数值的结果不可信。

3. 病理分析：HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

ICR小鼠灌胃感染CA10病毒5天后，取后肢骨骼肌、心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑置于10%福尔马林中固定72 h，经梯度酒精脱水后将其包埋在石蜡中，切片得到的石蜡切片厚度为 5 μm，随后进行H&E染色，最后在光学显微镜下观察组织病理变化。

（二）评价指标：

1. 临床症状评价：CA10病毒灌胃感染成功模型应具有典型的神经系统症状，即可观察到动物的重症肌无力表型，包括单后肢或双后肢瘫痪。根据临床评分标准，在灌胃感染CA10病毒观察期（12天）内，第5天可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；第7天出现死亡，但死亡率低于腹腔注射感染，后者在观察期内全部死亡。

2. 血液和组织中病毒复制情况评价体系：动物在灌胃感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉组织样本，在第5天采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺组织，测定其中的病毒载量。经灌胃感染CA10病毒后，第1天病毒载量都低于检测阈值。CA10病毒首先在血液中复制达到较高水平，第3天的检测值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒载量出现下降，检测值在105 copies/μl水平；而在后肢肌肉组织中，CA10病毒载量由第3天的106~107 copies/mg上升到107~108 copies/mg，说明病毒在肌肉中发生了大量扩增，具有典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上。

3. 病理评价体系：CA10病毒具有明显的嗜肌性，灌胃感染小鼠后肢肌肉中的病毒载量最高，临床症状也表现为后肢瘫痪，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润。除后肢肌肉外，在脾脏、胸腺和脑组织中也能观察到明显的病理变化，尤其是脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象，说明在小鼠CA10灌胃感染模型中也能出现神经性病变。

CA10病毒在人间传染病名录中属于第三类，涉及的实验需在BSL-2实验室进行，动物实验在ABSL-2实验室开展。CA10病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。

CA10病毒对5岁以下儿童易感，主要通过粪口传播，对于具有BSL-2防护装备的实验人员危害较小；实验人员均经过生物安全培训获得证书；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套，防护眼镜等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。

成年ICR小鼠对CA10病毒不敏感，21日龄ICR小鼠在感染大剂量病毒后仍能自愈。对于感染动物的排泄物进行检测，在少数粪便样本中检测到少量病毒，载量约为2X102~103copies/mg；因此需对垫料等接触动物粪便的物品按要求进行高压灭菌处理。

动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。

动物实验操作均在ABSL-2动物房的生物安全柜中进行，实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

本课题组采用7日龄ICR乳鼠、经灌胃CA10病毒的感染途径，成功获得CA10病毒灌胃感染小鼠模型。模型建立过程中采用临床评分标准对感染后动物的临床症状进行评价，并记录死亡率和体重情况；采用荧光定量PCR-标准曲线法对感染后动物血液和组织中的病毒载量进行测定，以确定病毒的复制情况；采用HE染色法对组织切片进行病理观察，确定组织病变情况。

本CA10病毒灌胃感染小鼠模型与文献报道的泰山医学院的史卫峰教授课题组的ICR乳鼠肌肉注射感染模型，都采用国际通用的封闭群ICR小鼠的乳鼠作为感染对象，都得到了具有典型神经系统病症的小鼠感染重症模型。在感染5天后动物出现明显的临床症状，包括驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，第7天观察到动物死亡；之后几日临床评分不断升高，最终大部分感染小鼠死亡（观察期结束时死亡率为80%）。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉组织样本，检测到病毒载量从第1天的低于检测水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），说明病毒在机体内的大量复制扩增；尤其是在肌肉组织中病毒载量的结果与临床症状相吻合。采集感染小鼠第5天心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，检测病毒载量在检测阈值之上，说明除了肌肉组织CA10病毒也能在其他组织中进行复制，并在脾脏、胸腺和脑组织中观察到了相应病变；尤其脑组织中的病变与重症患者的脑炎症状接近。

本模型与文献模型的不同之处在于：使用的病毒株不同，来自于不同病人的临床分离株；小鼠的日龄不同，我们使用7日龄的ICR乳鼠，相对于5日龄小鼠更易于操作；感染途径不同，我们采用灌胃感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更接近于病毒粪口传播的自然感染途径，有利于观察和研究CA10病毒的自然感染机制、嗜肌性以及对其他组织的损伤。

CA10病毒灌胃感染模型的建立需要确定乳鼠的日龄和感染的剂量。由于CA10病毒对5岁以下儿童易感，相应的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表现出症状。我们试验了7日龄和10日龄的乳鼠，发现10日龄乳鼠感染后症状表现不稳定，因此选取了7日龄乳鼠作为感染动物。对于病毒感染剂量，我们也尝试了106、107、108 TCID50，选择了症状更为合适和稳定的107 TCID50。

由于CA10病毒主要通过粪口传播，在自然感染状态下是经胃肠道侵入机体的，因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA1小鼠腹腔注射感染模型的基础上，通过灌胃方式建立的小鼠感染模型，为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础，也完善了应用于药物和疫苗开发实验的模型种类。