基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染恒河猴模型

一、疾病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human ImmunodeficiencyVirus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一

二、模型背景

1、病原信息

美国洛克菲勒大学的Aaron Diamond 艾滋病研究中心Cecelia教授以SIVmac239为骨架替换HIV-1SF162（R5,MT/NSI）的env, tat, rev, vpu等基因构建了表达HIV-1B亚型env的SHIVSF162PC，经恒河猴体内传代得到SHIVSF162p3。它具有高度复制能力、CCR5受体嗜性，并且能经粘膜传播，这些特性使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

2、实验动物背景信息

选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、研究背景

HIV融合抑制剂在病毒侵入宿主细胞前拦截病毒。T-20是目前唯一临床应用的病毒膜融合抑制剂，用于HIV-1感染的联合治疗。T-20的临床治疗作用虽然已被证明，但该药的抗病毒活性相对较低，半衰期短，需要每天注射两次（180 mg）；更为重要的是，T-20在体内外均容易诱导HIV耐药毒株的产生，极大地限制了它的临床应用。我们的前期结果表明，T-20在猴子体内的抗病毒效果欠佳。利用SHIV急性感染和慢性感染模型，我们发现LP-19、LP-50或LP-51通过低剂量和短期的单药治疗，均可以降低病毒载量至检测线水平。更为重要的是，单次低剂量的LP-80治疗（3mg/kg）可将病毒载量快速下降至检测线，且每周两次的单药治疗可长期抑制病毒（6个月）。基于此，我们拟建立基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染动物模型。

基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染动物模型的成功建立，可以深入研究该类药物在动物体内潜伏病毒的变化情况，有助于了解病毒储存库的形成、组织分布及定量情况，为潜伏库清除策略的研究奠定基础。该模型与基于HAART治疗的潜伏模型相比，具有单药治疗的优势，能更好地用于功能性治愈相关治疗策略的效果评价。

1、实验材料：SHIVSF162P3病毒；选用体重4-6 kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

2、静脉途径SHIV恒河猴感染模型制作方法：

先用宠物用电推剪推去猴上肢采血部位的猴毛，左手抓住一侧后肢跗关节部位，使后肢皮下静脉怒张。用75%酒精酒精棉球消毒。右手拿吸取病毒液的注射器，针头沿静脉平行方向向向心端刺入血管，见回血后，左手放松，不再紧压，右手缓慢将病毒液推入。完毕后用干棉球压迫止血，将注射器拔出，弃在利器专用桶内。

3、给药方法：将建立稳定的SHIVSF162P3慢性感染的恒河猴，经肌肉注射3mg/kg的HIV融合抑制剂，每周给药一次，连续给药6个月。

4、样本收集和检测：定期收集外周血样本，提取病毒RNA和病毒DNA，测定血浆病毒载量和总病毒DNA。

1、血浆病毒载量变化情况：

我们检测了LP-19、LP-50/LP-51和LP-80等HIV融合抑制剂在恒河猴感染模型的治疗情况。如图1所示，基于M-T钩子设计的短肽LP-19抑制剂可以将猴子体内SHIV病毒载量降到不可检测水平，而停药后在10天左右出现病毒反弹[1]。

图1 LP-19在恒河猴SHIV感染模型的治疗效果 与LP-19相比，LP-50和LP-51抑制剂的抗病毒活性得到极大的提高，达到极低的皮克摩尔（pM）水平。在恒河猴SHIV慢性感染模型，LP-51低剂量治疗可以迅速将病毒载量降到检测线以下，停药后两周左右出现病毒反弹[2]。值得关注的是，J0猴子经过反复的三次治疗仍然有效（图2）。

图2 LP-51在恒河猴SHIV感染模型的治疗效果 我们通过对LP-51进行结构优化获得LP-80，其在细胞水平上的抑制活性高于T-20和广谱中和抗体VRC01大于5300倍，在猴体内的活性高于T-20超过10000倍。在大鼠和恒河猴的药代动力学研究表明，LP-80在体内可以达到极高的药效浓度，且半衰期较长，适于每周1-2次给药治疗。如图3所示，LP-80对SHIV慢性感染猴子反复两次的治疗都表现出很好的治疗效果[3]。第一次治疗时，猴子采取每天给药联合每4天给药的方式，发现一周两次治疗可以很好地控制猴子的血浆病毒载量至检测线以下。待停药后病毒反弹稳定，我们继续给予一周两次、持续6个月的第二次治疗。

图3 LP-80在恒河猴SHIV感染模型的病毒RNA结果2、病毒DNA变化情况：LP-80不仅控制了血浆病毒RNA至检测线以下，而且有效地降低了病毒DNA的拷贝数，图4显示了LP-80治疗下病毒DNA的变化情况。

图4 LP-80在恒河猴SHIV感染模型的病毒DNA结果3、 血生化检测动物模型建立的整个实验过程中，全部实验猴分别在第一次治疗和第二次治疗前后检测血生化，未见明显差异。而且，在动物安乐后，各组织脏器未见明显异常。

1. 卫生部办公厅2012年9月26日发布的卫科教函【2012】287号，批准医科院动物所动物生物安全三级实验室（ABSL-3）从事高致病性病原微生物实验活动资格，其中，包括HIV-I型和HIV-II型，SIV及SHIV。

2. 本实验所用的SHIVSF162p3病毒，在研究所已完成风险评估，具有完整的标准操作程序，全部动物实验活动在ABSL-3实验室中进行。

3. 本次申报的新资源“基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染恒河猴模型”在实验过程中严格遵守研究所生物安全规章制度和动物实验规章制度，遵循SHIV病毒风险评估和标准操作程序。

4. 感染动物实验的开展获得IACUC委员会批准（IACUC号：ILAS-VL-2015-004）。

基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染动物模型，是恒河猴在成功建立慢性SHIV感染后，通过给予不同形式、不同剂量的HIV融合抑制剂，长期控制病毒RNA水平在检测线，同时在治疗期间，病毒DNA水平维持相对稳定。该模型用血浆病毒载量和病毒DNA作为病毒学评价指标体系；CD4细胞计数和CD4/CD8比值作为免疫学评价指标体系。我们在国际上率先利用HIV融合抑制剂在SHIV感染猴体内实现了血浆病毒载量的长期控制，在国际上处于领先地位（唯一）。该类潜伏感染模型可以深入研究HIV融合抑制剂在动物体内潜伏病毒的变化情况，有助于了解病毒储存库的形成、组织分布及定量情况，为潜伏库清除策略的研究奠定基础。该模型与基于HAART治疗的潜伏动物模型相比，具有单药治疗、长久疗效、注射制剂等三大优势，操作更方便，病毒载量控制更持久，且能更好地用于功能性治愈相关治疗策略的效果评价。