SLC16a3基因敲除心肌肥厚小鼠模型

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和(或)右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例和散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。临床表现：1. 以青壮年多见、常有家族史。2. 可以无症状，也可以有心悸、劳力性呼吸困难、心前区闷痛、易疲劳、晕厥甚至猝死，晚期出现左心衰的表现。3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左缘可出现粗糙的收缩中晚期喷射性杂音，可伴震颤，应用洋地黄制剂、硝酸甘油、静点异丙肾上腺素及Valsalva动作后杂音增强，反之应用β受体阻滞剂、去甲肾上腺素、下蹲时杂音减弱。有些病人闻及S3及S4心音及心尖区相对性二尖瓣关闭不全的收缩期杂音。临床诊断：超声心动图提示左心室壁或（和）室间隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血压病、风湿性心脏病二尖瓣病、先天性心脏病（房间隔、室间隔缺损）及代谢性疾病伴发心肌肥厚。二、模型背景1、SLC16a3基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：80879• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/80879• 敲除基因名称（MGI号）：SLC16a3（MGI: 1933438）• 敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000025161;r=11:120948480-120960868• 方案针对的转录本（Ensembl号）： ENSMUSG00000025161• 方案敲除的exon：exon2-exon52、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 该动物模型的研究目的及意义：探究SLC16a3在结核病病理过程中所发挥的作用及相关机制，从而为结核病的防治提供新见解。 SLC16a3是SLC16基因家族的一个成员，SLC16家族成员参与广泛的代谢途径，包括大脑，骨骼肌，心脏和肿瘤细胞的能量代谢，糖异生，T淋巴细胞活化，肠代谢，精子形成，胰腺β细胞功能异常，甲状腺激素代谢和药物转运，其中SLC16a3编码单羧酸盐转运蛋白（MCT4）催化质子联结的质子传递的单羧酸盐，如乳酸，丙酮酸和酮体穿过质膜。在LPS处理的树突状细胞和巨噬细胞中发现有增强有氧糖酵解作用，并发现在调节这些细胞活化中起重要作用。尽管细胞外乳酸的生物学活性已得到充分研究，人们对乳酸盐的输出是如何调节的，或者在炎性激活过程中乳酸盐的输出是否会影响糖酵解的研究较少，本研究通过研究Slc16a3的功能，深入完善乳酸盐的调节作用。参考文献：1. Geissmann F., Manz M. G., Jung S., Sieweke M. H., Merad M., Ley K.(2010) Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 327, 656–6612. Medzhitov R. (2008) Origin and physiological roles of inflammation. Nature 454, 428–4353. Takeuchi O., Akira S.(2010) Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140, 805–8204. Kawai T.,Akira S. (2010) The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373–3845. Medzhitov R.,Horng T. (2009) Transcriptional control of the inflammatory response. Nat. Rev. Immunol. 9, 692–7036. Jeannin P., Jaillon S., Delneste Y. (2008) Pattern recognition receptors in the immune response against dying cells. Curr. Opin. Immunol. 20, 530–5377. Vallabhapurapu S., Karin M. (2009) Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–7338. Nathan C., Ding A. (2010) Nonresolving inflammation. Cell 140, 871–8829. Hennessy E. J.,Parker A. E., O'Neill L. A. (2010) Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? Nat. Rev. Drug Discov. 9, 293–30710. Koppenol W. H., Bounds P. L., Dang C. V. (2011) Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat.Rev. Cancer 11, 325–33711. DeBerardinis R. J., Lum J. J., Hatzivassiliou G., Thompson C. B. (2008) The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metab. 7, 11–2012. DeBerardinis R. J., Thompson C. B. (2012) Cellular metabolism and disease: what do metabolic outliers teach us? Cell 148, 1132–114413. Pearce E. L., Poffenberger M. C., Chang C. H., Jones R. G. (2013) Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science 342, 1242454

项目设计：

Slc16a3基因有8个转录本。根据Slc16a3基因的结构，将Slc16a3-201(ENSMUST00000070653.12)转录本的外显子2-外显子5作为敲除区域，该区域含有起始密码子ATG编码序列，敲除该区域会导致蛋白质功能的紊乱。利用CRISPR/CAS9技术对SLC16a3基因进行修饰。方法如下：体外转录sgRNA，将sgRNA显微注射到C57BL/6JGpt小鼠受精卵中，移植受精卵，获得阳性F0小鼠，经PCR和测序证实。将F0代阳性小鼠与C57BL/6JGpt小鼠杂交，获得稳定的F1代小鼠模型。

项目策略图：

鉴定PCR结果图解：

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

SLC16a3基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。SLC16a3基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型（KO），该模型应用范围广，可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。