Pxdc1基因敲除脓毒血症小鼠模型

一、疾病概述 脓毒血症作为临床医学较为常见的疾病之一, 是一种由感染诱发的一系列病理、生理以及生化异常的综合征。其发病原因可能与下列因素有关:常发生于患有严重疾病或外伤的患者,还可常见于伴有慢性病或免疫力低下者 (如糖尿病、白血病以及再生障碍性贫血等)。其发病机制可能为:(1)病原体的外源性因子和损伤细胞释放的内源性因子均可与机体的模式识别受体相互作用;(2)脓毒血症炎症与凝血的相互影响;(3)免疫细胞的自我程序性死亡;(4)机体在受到感染刺激后大量炎性介质的释放。二、模型背景1、Pxdc1基因信息• 敲除基因名Pxdc1(NCBI：66895)• 除基因NCBI网址链接： https://www.ncbi.nIm.nih.gov/gene/66895• 敲除基因名称(MGI号): Pxdc1(MGI: 1914145)• 敲除基因EnsembI 网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000021411;r=13:34627841-34652681;t=ENSMUST00000125037• 方案针对的转录本（ Ensembl 号 ：ENSMUSG00000021411.16• 方案敲除的exon ：exon2- exon42、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 脓毒血症严重时可导致器官功能障碍或循环障碍,其预后效果较差, 具有高发病率、高病死率以及预后较差等特点[1]。在脓毒血症病情进展过程中，细菌释放的内毒素脂多糖(LPS)随血液循环累积于肺组织，引发常急性肺损伤[2]。TNF-α和 IL-6等炎症因子的检测水平为判断脓毒血症严重程度和疾病愈后的重要指标[3,4]。脓毒血症模型最经典的方法是盲肠结扎穿刺法（CLP），为研究脓毒血症的金标准[5]。 Pxdc1是一个印迹基因，位于6号染色体上。印迹基因是一个以亲本来源的等位基因特异性沉默为特征的一类基因[6]。在人类中，已鉴定出大约105个印迹基因座，其中许多在发育和生长中起着重要作用，印迹基因或区域的失调可导致多种疾病，例如Prader-Willi或Angelman综合征[7]。印记基因的表达紊乱还与多种癌症的发生相关联，例如胰岛素样生长因子 2 基因(insulin like growth factor 2, IGF2)的印记丢失会导致乳腺癌等癌症的发生[8]。在C57BL / 6小鼠中，TCDD激活AhR后，Pxdc1蛋白表达明显被抑制，AhR转录调控Pxdc1的表达，并且下调的Pxdc1蛋白可能参与TDCC导致的炎症反应[9]。我们构建Pxdc1 C57BL / 6敲除小鼠，并且建立C57BL / 6雄性和Pxdc1杂合雄性小鼠盲肠结扎穿刺法 (CLP)建立脓毒血症模型，肺部组织QPCR检测炎性因子，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β），验证是否Pxdc1调节机体的免疫反应，特别是感染导致的炎症性疾病。参考文献：1 Charchaflieh J, Wei J, Labaze G, et al. The role of complement system in septic shock. Clin Dev Immunol.2012,2012:407324.2 张婷,王祥瑞.脓毒血症休克的液体治疗[J].上海医药.2011,34(10):796.3 Celebi D, Aydin P, Cinar I, et al. Protective effect of luteolin on acute lung injury in a rat model of sepsis. Biotech Histochem.2020:1-7.4 Kabay B, Kocaefe C, Baykal A, et al. Interleukin-10 gene transfer: Prevention of multiple organ injury in a murine cecal ligation and puncture model of sepsis. World J Surg.2007,31(1):105-15.5 Medina E. Murine model of polymicrobial septic peritonitis using cecal ligation and puncture (clp). Methods Mol Biol.2010,602:411-5.6 Falls J G, Pulford D J, Wylie A A, et al. Genomic imprinting: Implications for human disease. Am J Pathol.1999,154(3):635-47.7 Peters J. The role of genomic imprinting in biology and disease: An expanding view. Nat Rev Genet.2014,15(8):517-30.8 Pan Y, He B, Lirong Z, et al. Gene therapy for cancer through adenovirus vectormediated expression of the ad5 early region gene 1a based on loss of igf2 imprinting. Oncol Rep.2013,30(4):1814-22.9 Prokopec S D, Lu A, Lee S C S, et al. Comparative toxicoproteogenomics of mouse and rat liver identifies tcdd-resistance genes. Arch Toxicol.2019,93(10):2961-2978.

1. 此模型采用CRISPR/Cas9技术对Pxdcl 基因进行基因编辑，原理示意图如下：

2. CLP脓毒血症模型：野生型和基因敲除小鼠麻醉后,腹部手术区常规消毒和去毛,分为假手术和手术组，无菌条件下用手术刀在腹壁作一长约2cm切口,经切口进腹，手术组在回盲瓣远端分离并以3号丝线结扎1/3处盲肠，用20 G 套管针将盲肠盲端贯通穿孔2 次，回纳腹腔，逐层缝合。

3. 将各实验组小鼠心室肌组织分别提取总RNA，应用qRT-PCR检测炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP的mRNA水平。、

4. 构建PE诱导的心肌肥大细胞模型，检测ArmH4敲低后心肌肥厚分子标志物水平，分别提取RNA，通过qRT-PCR检测炎症指标IL-6的mRNA水平。

通过杂合配杂合，繁育小鼠，统计Pxdc1对小鼠生育能力的影响。统计结果表明，Pxdc1敲除小鼠表现为纯和致死，杂合子小鼠未出现生长发育异常（表1）。

表1.Pxdc1 KO小鼠F3代杂合*杂合繁育子代小鼠数量统计。

1. 脓毒血症CLP模型结果 结果表明IL-1β，IL6，TNF-α，MCP在CLP处理后的野生型小鼠中mRNA表达量显著增高，表明CLP脓毒血症模型构建成功（图1）。在Pxdc1缺失小鼠中，IL-1β，IL6，TNF-α，MCP的mRNA水平显著提高。

图1.Pxdc1缺失对脓毒血症小鼠的影响。 2. 心肌肥厚模型 PE处理原代大鼠心肌细胞建立心肌肥厚细胞模型，过表达Pxdc1后检测IL-6的mRNA水平，结果表明过表达Pxdc1促进IL-6的mRNA的表达。

图2. 敲除Pxdc1加重PE所诱导的心肌肥厚水平。

PVM为低于人间传染病名录三级安全风险的病原，人类感染的风险低，但不排除对免疫功能缺陷者的致病性。

PVM是啮齿类实验动物必须排除的病原体，对动物有致病性。会干扰其他实验研究。

鉴于此，此感染实验必须在BSL-2级以上的生物安全实验室进行病原学实验，在ABSL-2实验室进行动物实验。

CLP成功建立脓毒血症模型，结果表明与WT小鼠相比Pxdc1 杂合小鼠的炎症指标IL-1β，TNF-α，MCP在Pxdc1 杂合小鼠肺部组织中表达呈下降趋势，但需要进一步研究以阐明Pxdc1在肺部炎症中的作用。