光化学法诱导食蟹猴脑缺血模型

一、疾病名称

缺血性脑卒中（Cerebralischemic stroke）

二、缺血性脑卒中简介

缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。

病因：血管缺血性损伤是由于各种原因诱发脑血管栓塞引起脑组织缺血、缺氧，进一步诱发脑神经细胞变性、坏死，最终导致神经功能障碍、丧失。从缺血的影响范围可将脑缺血分为局限性脑缺血和弥漫性脑缺血。局限性脑缺血的病因有：大脑中动脉栓塞；颅外颈内动脉或椎动脉狭窄、闭塞或血栓形成；脑动脉痉挛。弥漫性脑缺血的病因有：心搏骤停、低血压、贫血、低血糖等。

临床症状：突发的对侧肢体麻木、力弱、感觉障碍、单眼黑矇、眩晕、复视、双眼黑矇、共济障碍等。

治疗：根据分期分型对症治疗。发作频繁者，近期内发生脑梗塞的可能性很大，应积极治疗，防止发生脑梗塞。积极治疗危险因素如高血压、高血脂、心脏病、糖尿病、脑动脉硬化；预防性服用抗血小板积聚药物；改善脑循环。

1、模型制作

1.1术前准备：手术前12h禁食，6h禁水。氯胺酮15mg/kg对动物进行麻醉，当动物出现呼吸浅慢、角膜反射迟钝，为麻醉适度表现。

1.2制作局部脑缺血模型：麻醉后的动物采用俯卧位固定在立体定位仪上，颅顶区备皮，常规消毒手术区皮肤，沿矢状面在颅顶正中切开长约4 ～ 5 cm的切口，逐层分离皮下组织、帽装肌腱、肌肉、骨膜，用扩张器充分暴露手术视野。使用便携式颅钻在顶骨裂处进行颅骨钻孔，以钻透颅骨，达硬脑膜为止（有落空感）。钻好的孔为椭圆形，大小为3.0 cm × 1.5 cm，其长轴与颅骨正中线垂直。将冷光源发生器的发光口固定于颅顶开口处。周围用浸透生理盐水的无菌纱布覆盖伤口。用铝箔纸遮盖动物眼睛，避免光化学反应对动物视网膜的损害。静脉注射玫瑰红B35 mg/kg，从注射完毕开始计时，10 min后打开光源，电子光强选择6，机械光强选择C，照射10 min。第一次注射后5 min第二次注射玫瑰红B，浓度与第一次相同。第一点照射完毕后，向颞侧移动光源发光口，在第二点照射10 min。照射完毕，移去光源。缝合骨膜、皮肤。 肌肉注射青霉素40万U预防感染。

1.模型评价

1.1 行为学：

1）精准上肢运动测试

前期训练：实验者首先使动物消除恐惧心理，诱导动物能从实验者手中抓取水果块。与动物建立感情后，挂上实验装置，将水果块置于食槽中央。逐步引导动物从投食处取食。

每天上、下午固定时间各进行一次。训练期间每日喂食改为一次，每次30g，训练结束后给与。保证饮水。训练期间监控动物体重，根据体重调整喂食量。

数据采集：所有动物从实验装置中的采食状况稳定后进行本底数据采集。方法：将苹果切成2×2×2cm大小的正方形块，摆放在食槽中央，每次5块。用秒表记录动物将5块水果全部取走的时间。每次数据的采集在一天内完成，共5次，每次间隔2h。每次采集时，水果块的大小、形状及摆放位置要一致。造模后1d，3d，1w，2w，3w，4w采集实验数据，方法和采集时间与本底数据的采集相同。比较造模前后动物左上肢抓取水果块的时间，评价造模效果。

2）神经功能评分：造模后1d，3d，1w，2w，3w，4w使用经过修改、细化的Kito灵长类动物神经功能损害评分表对模型动物进行神经功能评分，其中意识28分，感觉系统22分，运动系统32分，骨骼肌共济协调18分共100分。

结果：动物在麻醉苏醒后均出现了与梗死部位相对应的神经系统定位体征。主要表现为动物苏醒后6h内表现为有意识但情绪低落，对疼痛和声音刺激不反抗。骨骼肌出现共济失调。左前肢出现明显的麻痹，不能抓握。术后3d部分动物的抓握能力有所恢复，但在采集数据的各个时间点，动物左上肢抓取水果块的时间上均存在极显著性差异。

1.2 影像学检查：

1）头颅MRI扫描：造模后24h，以后每2w一次进行MRI检查，观察血肿及周围的水肿、血肿情况；仪器型号：Philips Intera Achiva 3.0T磁共振仪，8道头部线圈。方法：将动物麻醉后固定于免磁的头架上，放入头部线圈内。T1扫描序列为IR，视野：120mm,TR/TE:2153ms/13/ms,层厚/间隔：3mm/0.3mm，矩阵256X256。

2）18F－FDG-PET头颅扫描：仪器：SiemensECAT EXACT HR+ 型高分辨PET仪（32环BGO晶体，空间分辨率5mm）。造模后24小时，以后每2周一次进行PET扫描。方法：动物麻醉后从股静脉注入 37-47MBq（1.0-1.3mCi）的 18F—FDG，30min后行PET检查，采用3D采集模式，扫描时间10min。观察梗死周围能量代谢情况。

结果：MRI检查结果可见在手术相应区域出现明显缺损，缺损面积随时间的推移减小。PET结果显示右侧大脑皮层梗死区代谢明显减低。（图3）

1.3 组织病理学检查：造模后12h、6w、12w后分别处死动物1只、3只、3只动物，取脑组织进行固定、切片，通过H.E染色、免疫组织化学染色方法观察梗死灶周围的病理学改变。使用AperioGL 系统对切片进行扫描和分析。

结果：大体观察：术后12h双侧大脑水肿，手术侧较未手术侧严重。右侧大脑手术区域可见明显梗死灶。6w、12w未见明显水肿，仍可见明显梗死灶。镜下：术后12 h：脑膜血管扩张充血。软脑膜下出血。局部脑组织（皮质）水肿，神经细胞数量减少，可见神经细胞变性坏死，毛细血管扩张充血。缺血灶最宽处面积达面积11.570mm × 3.687 mm。可见红染无结构物质嵌入大脑皮层。术后6w：脑膜血管扩张充血，局部内皮细胞脱落。软脑膜水肿。软脑膜下大脑皮质小灶性坏死，泡沫细胞浸润。坏死区面积3.186mm × 6.057 mm。坏死灶周围脑组织水肿，神经细胞变性坏死。术后12w：脑膜血管扩张充血，软脑膜下少量出血。局部大脑皮质轻度水肿。坏死区面积2.576mm × 5.377mm。

A 造模后12 h，脑组织水肿，可见明显梗死灶

B造模后12 h，梗死灶面积达3.687mm×11.57mm。

C造模后12 h，脑组织内毛细血管扩张充血，大脑皮质局部水肿（HE×200）

D造模后12 h，神经细胞变性坏死（HE ×400）

E造模后6w，未见明显水肿，可见明显梗死灶

F造模后6w，梗死灶面积3.186 mm × 6.057 mm

G造模后6w，脑组织坏死，泡沫细胞浸润（HE× 100）

H造模后6w，脑组织坏死区毛细血管内黄色结晶，泡沫细胞浸润（HE×200）

I造模后12w，未见明显水肿，可见明显梗死灶

J造模后12w，梗死灶面积2.576 mm × 5.377mm

K造模后12w，脑组织坏死，泡沫细胞浸润, 坏死区毛细血管内黄色结晶（HE× 100）

L造模后12w，神经细胞变性坏死（HE ×400）

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。