过敏性紫癜大耳白兔模型

一、疾病概况

过敏性紫癜（allegric puprura，AP），又称亨-舒综合症（Henoch-Schönlein purpura，HSP），是一种常见的血管变态反应性出血性疾病，以广泛的小血管炎为病理基础，皮肤紫癜、消化道粘膜出血、关节肿胀和肾炎等症状为其主要临床特征，是儿童中发病率最高的血管炎性病。流行病学研究提示，HSP的发病率为（10~22）/10万，好发年龄为3~10岁，并发症多，过敏性紫癜性肾炎（Henoch-Schönlein purpuranephritis，HSPN）是最严重的并发症。该病复发率高，病程迁延，患病率逐年升高，现代医学对其治疗无满意效果。

鉴于直接进行人体实验的局限性，在很大程度上需要通过动物实验进行，所以HSP动物模型在整个HSP的研究中具有举足轻重的作用。目前，关于过敏性紫癜动物模型构建的报道很少，因此对该病病因、发病机制、临床治疗评价和药物开发在一定程度上受到限制。

二、发病机制

病因不明确，一般认为与过敏有关，致敏原可能为食物、感染、药物、花粉或昆虫叮咬等，临床上常不确定。致敏原进入机体刺激浆细胞，产生抗体，与抗原结合形成免疫复合物，主要是IgA免疫复合物，过多的免疫复合物不易被巨噬细胞清除，刺激5-羟色胺、组胺等血管活性物质释放，血管壁通透性增加，组织水肿。免疫复合物在血管壁或肾小球膜上沉积，产生过敏毒素，使中性粒细胞在沉积处聚集，并释放蛋白水解酶，局部组织血管损伤加剧，沉积在胃肠黏膜小血管，引起胃肠道出血。该发病机制类似于可溶性免疫复合物引起的III型超敏反应。然而在相同条件下，很多人接受相同抗原刺激后，并未发生过敏性紫癜，而有些人则首次接触这些抗原刺激即可发生致敏反应，说明患过敏性紫癜的人需具备特异反应体质，并且研究发现这种特异反应体质具有家族倾向性，即基因易感性。

1．实验动物

1.5月龄日本大耳白兔24只，12只雌雄各半为模型组，12只雌雄各半为对照组，体重1.2～1.4kg，普通级动物房饲养。

2.模型构建

1）过敏体质的构建

中医热性药物干姜、荜茇、胡椒水煎剂以1:1:1的比例混合成15%的水溶液，4℃保存备用。动物适应1周后，模型组口服给药，1次/日，连续3周，对照组给以等量生理盐水，其它条件相同。

2）抗原致敏

腹腔注射卵白蛋白生理盐水与弗氏完全佐剂以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，1次/周，连续3 周。对照组腹腔注射等量的生理盐水。

3）抗原激发过敏反应

腹腔注射致敏3周后，动物耳缘静脉和皮内分别注射1%和0.3%卵白蛋白生理盐水，激发过敏反应。之后观察动物皮肤红肿状况，照相存档。

四、模型主要鉴定方式

非血小板减少性皮肤紫癜症状、血尿常规和便潜血、病理改变（包括炎症反应炎细胞浸润、IgA免疫复合物沉积等）、血免疫指标（血清IgA及相关免疫细胞及细胞因子）等。

1.模型的皮肤特征

兔耳缘静脉及皮内注射卵白蛋白生理盐水溶液后，皮肤注射部位均会出现直径1 cm左右的皮丘，6 h后模型组兔的背部皮丘逐渐变大，且周围水肿，皮内血液渗出；至18h左右，呈现片状紫斑，直径2-10mm，形状不规则，大小不等，还有一些斑点出现在耳朵和腿部（图1）。在激发第8天左右，皮肤紫癜开始变小，渗出减少，20天左右，症状明显改善。皮肤症状出现的比例约为85%。

注：a、对照组兔的背部皮肤b、模型组兔的背部皮肤

图1 激发后兔的外部特征观察

2.模型病理特征

（1）脏器组织形态学改变

模型动物病理表现为皮下出血，真皮水肿，血管扩张充血、出血，炎细胞浸润；肾小球囊腔蛋白渗出物，血管扩张充血及局灶性慢性肾炎，肾小球系膜基质增多，系膜增厚，红细胞管型，炎细胞浸润等；还可见到关节腔滑膜淤血，结缔组织坏死，炎细胞浸润等；胃黏膜可见出血，坏死脱落；小肠绒毛血管扩张充血，上皮细胞脱落；肺淤血，肥大细胞似有脱颗粒现象；肝灶性炎细胞浸润等等（图2）。

注：a.真皮水肿，炎细胞浸润；b.真皮血管充血，出血；c.皮肤正常对照；d.肾小球囊腔蛋白渗出物，炎细胞浸润；e.肾小球系膜增厚，血管扩张；f.肾正常对照；g. 关节滑膜淤血，结缔组织坏死，炎细胞浸润；h.胃黏膜水肿，上皮细胞脱落；i.肺淤血，伴肥大细胞脱颗粒。

图2 过敏性紫癜兔模型的组织病理改变

（2）皮肤、肾脏免疫复合物沉积

免疫荧光检测发现IgA免疫复合物在模型组兔皮肤主要沉积在皮肤真皮层血管壁、肾小球系膜区，血管壁及肾小球入球小动脉壁，常呈斑点状、团块状、分支状或短线状分布（图3）。

注：a.模型组兔皮肤组织，b. 对照；e.模型组兔肾脏组织，f 对照。

图3 皮肤和肾脏的免疫荧光检测

（3）肾小球纤维增生性改变

肾脏Masson染色结果显示模型组动物（a）肾小球系膜纤维化增生，胶原纤维蛋白增多，使得系膜增厚，基质增多，与（c）图PAS染色结果模型组兔肾小球系膜增生，系膜基质增厚相一致（图4,5）。

注：图a, b分别为模型组和对照组兔的肾脏Masson染色；c,d分别为模型组和对照组兔的肾脏PAS染色。

图4 兔肾脏Masson和PAS染色

图5 兔肾脏masson和PAS染色单个肾小球内胶原蛋白及糖原面积的百分比

（4）皮肤和肺脏的嗜酸性细胞浸润

嗜酸性粒细胞的皮肤（图a,b）和肺脏（图c,d）Luna染色，表现为单位面积（1mm2 ×40倍）视野内模型组兔皮肤真皮层和肺间质内嗜酸性粒细胞明显增多（图6,7）。

图a（模型组），b（对照组）为皮肤Luna染色；图c（模型组），d（对照组）为肺组织Luna染色

图6 兔皮肤和肺组织的Luna染色

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组

图7 兔皮肤和肺组织的Luna染色单位面积嗜酸性粒细胞含量

（三）血尿常规及便潜血改变

血白细胞WBC升高，RBC相对于减少，PLT数量激发后无差异性改变，NEU、NEU%均升高，EOS、EOS%升高（图8）。尿液变稠表面观察有拉丝现象，气味大，67%尿蛋白阳性，尿红细胞阳性；实验前便潜血检测阴性，激发实验后70%便潜血阳性。

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组.

图8 过敏性紫癜兔模型血常规改变

长春中医药大学4～12岁，住院 2～5天的12名患者血常规检测白细胞（WBC），粒细胞（Gran），单核细胞（MONO）及百分比MONO% 明显增加，分别超出正常范围的百分比为33.3% (4/12)，25% (3/12)，41.6% (5/12)，33.3% (4/12)。淋巴细胞百分比（LYMPH%）明显减少，低于正常参考范围的比例为25% (3/12)，血小板未见明显异常改变（表1）。

表1 患者血常规检测

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组.

（四）模型血免疫指标改变

HSP兔血清IgA升高，IgG降低，C3，C4减少，IgE无明显改变（图9）。外周血CD3+T细胞数目减少，CD4+T细胞减少，CD8+T细胞增多，CD8+T细胞所占百分比升高，CD4+T细胞百分比下降，IL-2水平下降，TNF-α水平升高（图10）。

长春中医药大学4～12岁，住院 2～5天的12名患者血清IgA， IgE升高（p<0.01），IgG升高（p<0.05），C3，C4减少（p<0.05）。血CD4+T细胞百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差别均具有统计学差异。（图11,12）

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组.

图9 HSP兔模型血清免疫球蛋白和补体改变 图11 HSP患者血清免疫球蛋白和补体改变

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组.

图10 HSP兔模型血免疫细胞及细胞因子的改变

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相对于对照组.

图11 HSP患者血免疫细胞及细胞因子的改变

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。