G蛋白偶联受体激酶4转基因高血压小鼠模型

一、疾病名称

高血压是以体循环动脉压增高为主要表现的临床综合征，是严重危害人类健康的常见心血管病之一，目前高血压患者约有10亿，如不采取积极有效的预防措施，预计到2025年，的高血压患者可能会再增加80%。此外，高血压还是脑卒中、心肌梗死等心血管疾病以及慢性肾脏疾病等最主要的危险因素。因此，高血压已经成为威胁人类生命健康的重要的公共卫生问题，其防治具有重要的现实意义。

二、疾病临床表现及致病机制

高血压的症状因人而异。早期可能无症状或症状不明显，仅仅会在劳累、精神紧张、情绪波动后发生血压升高，并在休息后恢复正常。随着病程延长，血压明显的持续升高，逐渐会出现各种症状。此时被称为缓进型高血压病。缓进型高血压病常见的临床症状有头痛、头晕、注意力不集中、记忆力减退、肢体麻木、夜尿增多、心悸、胸闷、乏力等。当血压突然升高到一定程度时甚至会出现剧烈头痛、呕吐、心悸、眩晕等症状，严重时会发生神志不清、抽搐。这就属于急进型高血压和高血压危重症，多会在短期内发生严重的心、脑、肾等器官的损害和病变，如中风、心梗、肾衰等。症状与血压升高的水平并无一致的关系。

高血压有两种情况，一种是原发性高血压，一种是继发性高血压。基于目前的医学发展水平和检查手段，能够发现导致血压升高的确切病因，称之为继发性高血压；反之，不能发现导致血压升高的确切病因，则称为原发性高血压，占血压高总人数的90%～95%。高血压人群中多数为原发性高血压，但明确诊断原发性高血压，需首先除外继发性高血压。继发性高血压是由于某种具体的疾病引起的血压高，病因是清楚而明了的，大约占高血压总数的5%～10%，一般多由肾实质病变、肾动脉狭窄、嗜铬细胞瘤、原发性醛固酮增多症、库欣综合征、主动脉缩窄等疾病引起。

目前认为原发性高血压是一种某些先天性遗传基因与许多致病性增压因素和生理性减压因素相互作用而引起的多因素疾病。这些因素主要包括：遗传因素；高钠、低钾膳食；超重和肥胖；饮酒；精神紧张及其他危险因素包括年龄、缺乏体力活动等。

2005年美国高血压学会（ASH）提出，高血压是一个由许多病因引起的处于不断进展状态的心血管综合征，可导致心脏和血管功能与结构的改变。因此，原发性高血压治疗的主要目的是最大限度地降低心血管的死亡和病残的总危险。

多巴胺和肾素-血管紧张素系统是两个最主要的血压调控途径，二者与细胞间第二信使系统协同调节体内水钠平衡，GRK4（G蛋白偶联受体激酶4G-protein-coupled receptor kinase 4, GRK4）则在多巴胺介导的尿钠排泄中发挥重要的作用。GRK4是唯一有4个剪接变异体（GRK4α,β, γ和δ）的GRKs家族成员，编码GRK4的基因定位4p16.3，该位点已被证实与高血压的发生相关。GRK4的突变与肾脏促尿钠排泄功能受损和高血压的发生密切相关，其中R65L（rs2960306）、A142V（rs1024323）和A486V（rs1801058）是现阶段研究频率较高的三个突变。在对中国北方汉族人群的研究中发现，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同时存在可使高血压的发生风险较无突变人群高6倍。

目前建立的人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种基因转基因小鼠，对其进行血压动态对比分析。结果发现，GRK4γ野生型和GRK4γR65L突变转基因小鼠血压正常；GRK4γA142V突变转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下即可发生高血压，而GRK4γA486V突变转基因小鼠只有在增加钠盐摄入情况下才发生高血压，说明GRK4γ的不同突变会引起不同类型的高血压。

用PCR的方法克隆人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种基因的开放阅读框，，均插入系统性表达的启动子下游构建人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种表达载体。用显微注射法将四种转基因载体分别注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制备四种转基因小鼠。

（一）GRK4γ wt/R65L/A142V/A486V 转基因小鼠基因型及表型

提取小鼠基因组DNA，用PCR法扩增623bp的目的片段，鉴定小鼠基因型（图1A）。提取心脏、肾脏和肾上腺组织总蛋白，用GRK4抗体进行Western Blot分析，确定转基因小鼠GRK4的高表达（图1B）。通过比较对照组（NTG）和转基因小鼠中GRK4表达水平，筛选到在心脏、肾脏和肾上腺均高表达GRK4基因的转基因小鼠品系。

图1 GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变转基因小鼠的建立

A. PCR鉴定GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变转基因小鼠基因型；1为空白对照；2为阴性对照；3为阳性对照；5、8、11、13为阳性转基因小鼠；4、6、7、9、10、12为阴性转基因小鼠。

B. Western Blot分析GRK4蛋白在转基因小鼠心脏、肾脏和肾上腺组织中的表达，GAPDH为内参；

（二）正常饮食GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

NTG 和转基因阳性小鼠于2、4和8月龄进行血压动态分析。结果显示，NTG和转基因阳性小鼠平均动脉血压（mean arterial pressure, MBP）[平均动脉血压＝舒张压＋1/3（收缩压﹣舒张压）]均随着年龄的增长而增加。与NTG小鼠相比，GRK4γ野生型和GRK4γR65L转基因小鼠血压正常；GRK4γA142V转基因小鼠在8月龄时血压显著升高（P=0.009）；而GRK4γA486V转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下并未出现高血压表型（图2）。说明，外源性转入人源GRK4γ野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突变不会影响正常钠盐摄入情况下血压水平，而GRK4γA142V突变即使在正常钠盐摄入情况下仍会引起血压升高。

图2 正常饮食GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变的转基因小鼠血压动态对比分析（注：*P<0.01；**P<0.01）

（三）高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

于2月龄时将NTG和GRK4γA486V转基因小鼠随机分成四组，即NTG正常饮食组（N=8）、GRK4γA486V正常饮食组（N=5）、NTG高盐饮食组（N=6）和GRK4γA486V高盐饮食组（N=6）。正常膳食饮食组饲料中氯化钠含量为0.06%，高盐饮食组饲料中氯化钠含量为4%，连续喂养4周后恢复正常饮食，并对各组小鼠进行血压动态分析。结果显示，经过高盐饮食刺激，与正常饮食组NTG小鼠相比，高盐饮食组NTG小鼠MBP虽有所升高但无显著性差异；而高盐饮食组GRK4γA486V转基因小鼠较正常饮食组GRK4γA486V转基因小鼠MBP显著升高（P=0.0007），且MBP变化值为7.53mmHg（图3）。临床上，将因钠盐摄入量增多而导致的MBP升高值≥ 7mmHg的高血压定义为盐敏感性高血压。由此可知，GRK4γA486V突变诱导高血压属于盐敏感性高血压。

图3 高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。