病毒性肝损伤小鼠感染模型

人乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitisB virus, HBV）感染引起的传染病，至少有20亿人曾经被乙肝病毒感染。HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，据目前所知，HBV只对人和猩猩有易感性。HBV在肝内繁殖复制，但是对肝细胞无明显的直接损伤作用，但会引发免疫系统攻击感染HBV的肝细胞，形成慢性肝炎，继而发展为肝纤维化，是引发肝癌的重要因素。

目前，由于HBV疫苗的使用，使HBV感染率显著降低，但慢性乙肝存在较大的转为肝癌的风险。由于缺乏理想的乙肝动物模型，限制了针对乙肝病程发展和干预治疗策略的研究进展。

1978年，萨默斯(Summers)等发现费城动物园的土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck HepatitisVirus，WHV）。WHV与HBV在形态学、基因结构、基因产物、复制过程、流行病学及疾病和肝癌的发展上有很高的相似性，WHV可引起急性自限性感染和慢性感染，其发病机理及免疫反应机制和HBV类似。WHV感染成年土拨鼠会导致急性自限性肝炎，而感染新生土拨鼠会发展为慢性肝炎，慢性肝炎易发展为肝细胞癌（HCC），土拨鼠模型的疾病发展特征使其成为研究慢性乙型肝炎向终末期肝病转化的理想动物模型。

1. 病毒制备

WHV为cWHV7P1毒株（NCBI存储号:M18752.1），来自美国乔治敦大学微生物与免疫室，采集来自慢性感染土拨鼠的血清，病毒储存液浓度为1×1010 拷贝/ml。

2. 动物

7日龄-1月龄土拨鼠。实验前进行血清病毒WHV DNA 的PCR检查，阴性土拨鼠方可入组。

3. 感染实验

动物经兽用氯胺酮麻醉后，经颈外静脉注射WHV，感染剂量分别为5×106 WID50（低剂量）和1×107 WID50（高剂量），感染体积为100 μl，病毒储存液用生理盐水稀释，对照组土拨鼠注射等体积的生理盐水，感染后的土拨鼠隔离饲养。在感染后不同时间点，动物经兽用氯胺酮麻醉后，心脏取血，离心分离血清。

4. 血清检测

感染后血清标志物检测：土拨鼠肝炎病毒表面抗原（WHsAg）和核心抗原（WHcAg）经过大肠杆菌原核表达系统表达，经镍离子亲和层析纯化。WHsAg分别免疫兔和鸡后获得兔抗WHsAg抗体和鸡抗WHsAg抗体。通过ELISA双抗夹心法检测WHsAg，ELISA直接法检测WHcAb。

5. 核酸检测

使用DNA提取试剂盒QIAamp MinEluteVirus Spin Kit从50μl血清中抽提 WHV DNA。利用实时荧光定量PCR测定血清中WHV DNA拷贝数，引物为WHVSF1WHVSR1(5’-GGCAACAACATAAAAGTCAC-3’5’-AACTAAACCACGTGGTATGTC-3’)，梯度稀释的WHV DNA质粒做标准品。

5. 肝功能检测

取血样检测感染后土拨鼠肝功能酶：丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)。

6. 病理诊断

甲醛固定的土拨鼠肝脏组织经石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE染色，显微镜下观察病理改变。

7. 免疫组化

肝脏病变组织经过组织修块，石蜡包埋后，切片厚度为4μm，经脱蜡水化，抗原修复，滴加20%正常山羊抗血清室温封闭后，滴加兔抗WHsAg抗体，稀释比例1:500,4度过夜。次日PBS洗涤，滴加荧光标记二抗，稀释比例1:5 000，PBS洗涤后，DAB显色，脱水封片，镜下观察。

1. 急性期肝炎

土拨鼠感染WHV后第8周，血清中病毒载量达到最高峰（106拷贝/ml，图1），血清中WHsAg浓度与病毒载量相对应，在感染后8周达到最高值（图2A），感染后血清中WHcAb自第2周开始检出，且浓度不断升高，低剂量组的WHcAb浓度在第8周达到最高峰，而高剂量组则持续增高（图2B）。在此期间，土拨鼠的肝功酶活性维持在较高水平：ALT和AST分别达到正常值的4～8倍和3～4倍（图3）。自感染后至16周，病毒复制、血清学指标和肝功能均处于较高水平，表明WHV感染的土拨鼠在此阶段处于急性肝炎期。急性肝炎期的病理表现为：汇管区肝细胞出现点灶状肝细胞坏死伴炎细胞浸润及散在出血（图4A、4B），免疫组化染色显示肝细胞胞浆出现大量的WHsAg染色颗粒 (图4C、4D)。

图1土拨鼠血清中病毒载量（lg 拷贝/ml）

2. 土拨鼠肝炎病毒感染后急性期向慢性期的转变

感染后16周至24周，低剂量组土拨鼠血清中病毒DNA逐渐降低并消失（图1），与此相对应，其血清中WHsAg也渐趋于消失（图2A），而WHcAb则维持在较低水平（图2B）。同时，低剂量组土拨鼠的肝功酶ALT和AST也逐渐降低到感染前水平（图3），这些结果表明：低剂量组感染土拨鼠已由急性感染转为自愈。与低剂量组相反，高剂量组土拨鼠血清中病毒载量一直处于较高水平，截止到检测之日（第24周），病毒DNA拷贝数一直维持在105拷贝/ml左右（图1）。与急性期相比，血清中WHsAg浓度略有下降（图2A），但WHcAb浓度则不断增高（图2B），同时，肝功酶ALT和AST的水平呈下降趋势，但仍为正常值的1倍左右（图3）。该结果表明：高剂量组土拨鼠仍维持低水平感染，提示向慢性肝炎的转变。

图2A 土拨鼠血清中表面抗原检测 (OD450)

图2B土拨鼠血清中核心抗体检测结果(OD450)

图3A 土拨鼠血清肝功酶AST检测结果（U/L）

图3B 土拨鼠血清肝功酶ALT检测结果（U/L）

图4 低剂量组16周肝脏病理变化。注：A、C为对照组肝脏HE染色和免疫组化WHsAg染色结果。B 为低剂量组感染后第16周肝脏组织HE染色，D为WHsAg免疫组化染色

WHV病毒具有种属特异性，只感染土拨鼠，不感染人和其他实验动物；且未出现在《人间传染的病原微生物名录》中。动物感染病毒和饲养都可在普通环境中进行，但需跟土拨鼠繁殖区分开。WHV病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。模型实验已得到IACUC批准，获得实验资质。

WHV病毒只对土拨鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的实验动物；在土拨鼠种群中常为垂直感染模式，实验室中采用的为血液感染模式。为预防对其他土拨鼠的影响，实验人员均需经过生物安全培训获得证书，具有生物安全操作资质；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。尽量避免进入感染动物区后再进入繁殖区，若需进入则应更换整套个人防护设备。

由于感染WHV土拨鼠血液中可能存在着大量病毒，因此对于采血后的耗材、以及沾染到血液的垫料等，都需要进行高压灭菌处理，以消除正常土拨鼠的潜在感染源。动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。

动物实验操作均在ABSL-2动物房的生物安全柜中进行，实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

（一）模型评价方法：

1. 临床症状观察：

血清中肝功生化指标的两种转氨酶（ALT，AST）是肝损伤的重要标志物，GGT的变化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情况，同时对于肝脏肿瘤也具有一定的指示作用。这些指标可通过常规血清检测得到数据。

2. 病毒载量测定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清样本处理：用促凝采血管收集的血样，室温放置30min后，3000rpm室温离心10min，得到上层血清放入离心管中备用；组织样本处理：检测WHV病毒载量主要组织样本为肝脏，分别在每个肝叶取约50mg样本，用生理盐水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至组织破碎完全。使用DNA提取试剂盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需长期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒载量的测定：实时荧光定量PCR方法

实验前准备：DNA样品制备：待测样本：待检测的感染WHV病毒的土拨鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；标准品：已知浓度的WHV-DNA质粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl进行稀释；空白对照：分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；阴性对照：未感染WHV病毒的土拨鼠血清；

实验步骤：（a）每个待检测样本反应液的组成为：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）扩增条件设定：

（3）仪器检测通道选择：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪时选择SYBR Green荧光信号，收集设在58℃。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

（4）结果分析阈值设定：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪进行结果分析，基线和阈值设定根据仪器噪音情况调整。

（5） 荧光定量PCR反应系统的质量控制：

a. 反应结果应同时符合以下条件，否则实验结果无效。

阴性对照：无扩增，为阴性。

标准品：CT值＜28

否则结果无效。

b. 结果判断：

阴性：无CT值或CT值大于38

阳性：CT值＜38，可报告为阳性。

CT值大于38的样本建议重做，若重做结果CT值＜38，该样本判断为阳性，否则为阴性。

阳性样本具体载量根据标准曲线进行计算。

图5. 荧光定量PCR实验的扩增曲线和标准曲线

3. 病理分析：HE染色

组织样本经固定、包埋、切片处理后，可通过H&E染色观察感染动物组织内的损伤情况和炎性细胞的浸润状况。具体步骤如下：

用10%福尔马林固定72h，在24h内可换液一次；将固定的组织修块后脱水、透蜡用石蜡包埋；随后石蜡块进行切片；石蜡切片脱蜡后，进行苏木精染色；切片继续脱水后染伊红；最后进行透明、封片，得到HE病理切片，可进行镜检。标本切片可长期保存。

（二）评价指标：

1. 临床症状评价：

由于免疫系统未发育完全，新生土拨鼠感染WHV病毒后，有60%-70%的概率发展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指标（ALT和AST）都有升高，表现出肝脏损伤；而长期的病毒复制导致慢性肝炎，期间虽然血液中检测的病毒载量会有波动，但肝部损伤加剧，且肝脏炎症和肿瘤标志物指标升高。

2. 病毒复制情况评价体系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6个月达到峰值，平均载量约为107copies/ml。此后由于机体无法清除病毒，WHV在肝脏中长期复制，在血液中能持续检测到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分时间维持在104copies/ml。

3. 病理评价体系：

WHV病毒感染土拨鼠，在慢性期肝脏病理发生显著变化，可观察到慢性炎症表型，包括：肝窦扩张，大量炎细胞弥漫浸润等。