D173L转基因原发性高血压小鼠模型

原发性高血压是指原因不明，以动脉收缩压和（或）舒张压增高为特征，常伴有心、脑、肾等器官病理性改变的全身性疾病。原发性高血压占高血压患者的95%以上，在我国的影响人口超过1亿人。高血压对心脏、肾脏、脑均有影响，还可以造成眼底动脉硬化导致失明等并发症。

原发性高血压发病机制尚未明确，一般认为是基因和环境相互作用的共同结果，流行病学调查表明, 原发性高血压有明显的遗传倾向。近20年来的研究发现，多巴胺通过抑制肾小管钠的重吸收，对原发性高血压的发生、发展起到重要的作用[1][2]，其可以通过自分泌/旁分泌的方式分泌到肾小管管腔、调节RPT段和髓袢升支粗段中的钠转运，可在肾单位的多个节段上抑制Na+的转运，还可以通过抑制Na+-K+-ATPase活性实现利尿作用。多巴胺是通过多巴胺受体影响钠的重吸收从而发挥其功能，近期的研究发现D5受体基因位点（chromosome4p15.1-16.1）与原发性高血压有相关性，人D5受体基因多态性相关功能异常，包括 L88F、F173L、A269V、P330Q、C335X、N351D、S390G和S453G，研究发现转染D5突变基因F173L后， CHO细胞刺激腺苷酸环化酶的活性降低, O2-产量显著增加，因此,我们构建了D5F173L全身表达及心脏特异性表达的转基因小鼠 ,从而进一步研究多巴胺D5受体在高血压及心肌病发生发展过程中的重要作用。结果发现，D5F173L全身表达转基因小鼠。

D5F173L转基因多巴胺小鼠模型。

背景品系为C57BL/6小鼠，属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、家鼠属、家鼠种的动物，1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL，1937年从C57BL分离出C57BL/6亚系培育而成。

由美国乔治敦大学Pedro A. Jose博士惠赠的pcDNA-h-D5F173L表达载体人D5F173L质粒，转化入大肠杆菌JM109，摇菌扩增后测序，测序结果经Blast分析，显示得到的pcDNA-D5-F173L与Genebank 中序列对比得到目的突变位点正确。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL小鼠的受精卵中，用C57BL小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。转基因小鼠用碱裂解法提取基因组DNA。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因小鼠肾组织中D5R的表达。（图1,图2）

图1 F1代转基因鼠的PCR检测

P：阳性对照；H：空白对照；N：阴性对照； M：DL2000 图中37 9 10 15 17 20

21 22 24 27 33 34 35为F1代阳性转基因小鼠；

图2 Western Blotting 鉴定D5 F173L转基因小鼠D5受体蛋白在肾脏的表达

1:野生型对照小鼠，2:32号首建鼠的F1代小鼠，3:4号首建鼠的F1代小鼠，

4:16号首建鼠的F1代小鼠

1.多巴胺D5受体D5F173L转基因小鼠血压值

分别测量D5F173L、D5S390G和hD5WT小鼠以及阴性对照小鼠血压值，组间比较结果显示：D5F173L转基因小鼠三至六月龄收缩压、舒张压和平均动脉压都明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠(* P<0.05 vs. D5WT, 阴性对照, n=6，t test) 。

图1.D5F173L、D5S390G和D5WT转基因及非转基因对照四个实验组小鼠三月龄至六月龄收缩压、舒张压及平均动脉压比较.

1.2 比较各组小鼠收缩压，舒张压及平均压随时间变化情况（三月龄至六月龄），分析结果显示：各组小鼠随月龄增加收缩压差异无显著性变化(* P>0.05 ,n=6，t test)； D5F173L转基因小鼠舒张压随年龄增加呈有上升趋势，且四月龄较三月龄比较有显著性差异(*P<0.05 ,n=6，t test)，其他各组转基因小鼠舒张压无明显变化(*P>0.05 ,n=6，t test)；D5F173L转基因小鼠平均压随年龄增加有上升趋势，但各月龄间无显著性差异 (* P>0.05,n=6，t test)，其他各组转基因小鼠平均压无明显变化趋势(* P>0.05,n=6，t test)。

图2 四组小鼠的收缩压，舒张压及平均压随月龄变化分析（三月龄至六月龄）

A：各组基因小鼠及阴性对照小鼠三月龄至六月龄收缩压比较

B：各组基因小鼠及阴性对照小鼠三月龄至六月龄舒张压比较

C：各组基因小鼠及阴性对照小鼠三月龄至六月龄平均压比较

2.心脏超声结果

2.1 心脏超声，主动脉瓣血流多普勒频谱图像:显示小鼠左心室结构，获得左心室运动曲线，主动脉瓣血流频谱图像。

图3 左室M超，主动脉瓣血流及组织多普勒频谱图像

A: M超显示左室长轴乳头肌水平左室运动曲线

B: M超显示左室短轴乳头肌水平左室运动曲线脉冲

C: 多普勒测定的主动脉瓣血流频谱

2.2 左心室内体积分析显示：D5F173L转基因小鼠舒张末期和收缩末期左室内体积均明显低于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.01 vs D5WT, 阴性对照, n=6，t test)，提示多巴胺D5突变基因173L(D5F173L)转基因小鼠血压升高后可引起心脏继发性左心室室腔增大。

图4 四月龄至六月龄多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L), S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠舒张末期和收缩末期左室内体积比较：

A:四个实验组小鼠四月龄舒张末期和收缩末期左室内体积比较。

B:四个实验组小鼠五月龄舒张末期和收缩末期左室内体积比较。

C:四个实验组小鼠六月龄舒张末期和收缩末期左室内体积比较。

2.3 舒张末期左室内径，左室前后壁及左室收缩功能相关性分析显示：

a）左室内径变化：四到六月龄D5F173L转基因小鼠舒张末期左室内径均明显低于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠(* P<0.01 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

b)左室前壁变化：D5F173L转基因小鼠舒张末期左室前壁与hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠相比四月龄无显著性变化，五月龄及六月龄明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.05 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

c)左室后壁变化：四到六月龄D5F173L转基因小鼠舒张末期左室后壁均明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

d）D5F173L转基因小鼠舒张末期左室内体积与左室内径随月龄的增加均呈显著性减小的趋势且具有统计学意义（P<0.05，n=6，t test），同时其舒张末期左室前后壁厚度则呈显著性增加。

图5 四月龄至六月龄多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠舒张末期左室内径，左室前后壁厚度比较：

A:四个实验组小鼠四月龄舒张末期左室内径及左室前后壁比较。

B:四个实验组小鼠五月龄收缩末期左室内径及左室前后壁比较。

C:四个实验组小鼠六月龄舒张末期左室内径及左室前后壁比较。

图6 四个实验组小鼠舒张末期左心室相关参数随年龄的变化：

A:四个实验组小鼠舒张末期左室内体积随月龄增加的比较。

B:四个实验组小鼠舒张末期左室内径随月龄增加的比较。

C:四个实验组小鼠舒张末期左室前壁随月龄增加的比较。

D:四个实验组小鼠舒张末期左室后壁随月龄增加的比较。

2.4 收缩末期左室内径，左室前后壁及左室收缩功能相关性分析显示：

a)内径变化：四到六月龄D5F173L转基因小鼠收缩末期左室内径均明显低于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

b)前壁变化：D5F173L转基因小鼠收缩末期左室前壁与hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠相比四月龄无显著性变化 (* P>0.05 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；五月龄及六月龄D5F173L转基因小鼠收缩末期左室前壁均明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

c)后壁变化：四到六月龄D5F173L转基因小鼠收缩末期左室后壁均明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 阴性对照, n=6，t test)；

d) D5F173L转基因小鼠收缩末期左心室内体积与左心室内径随月龄的增加显著减小（P<0.05，n=6，t test），收缩末期左室前后壁厚度显著性增加（P<0.05，n=6，t test）；其余三组小鼠收缩末期左室内体积、左室内径及左室前后壁随月龄有变化趋势但无显著性差异（P>0.05，n=6，t test）。

图7 四月龄至六月龄多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠收缩末期左室内径，左室前后壁厚度比较

A:四个实验组小鼠四月龄收缩末期左室内径及左室前后壁比较。

B:四个实验组小鼠五月龄收缩末期左室内径及前后壁比较。

C:四个实验组小鼠六月龄收缩末期左室内径及前后壁比较。

图8 四组小鼠舒张末期左室内相关参数随月龄的变化：

A:四个实验组小鼠舒张末期左室内体积随月龄增加的比较。

B:四个实验组小鼠舒张末期左室内径随月龄增加的比较。

C:四个实验组小鼠舒张末期左室前壁随月龄增加的比较。

D:四个实验组小鼠舒张末期左室后壁随月龄增加的比较。

2.5 左心室缩短分数分析显示： D5F173L转基因小鼠左心室缩短分数四至六月龄均明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠，且随月龄增加差异显著性增加(* P<0.01 vs. D5WT, 阴性对照, n=6，t test) 。

图9 多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠左心室缩短分数的变化

A:各实验组小鼠四至六月龄间左室缩短分数比较。

B:同月龄内各实验组小鼠左心室缩短分数比较。

2.6左心室重量分析：D5F173L转基因小鼠左室重量四至六月龄均明显高于hD5WT转基因小鼠及非转基因小鼠，且随月龄增加差异显著性增加(*P<0.05 vs. D5WT, 阴性对照, n=6，t test)

图10 多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠左室重量的变化

A:四组小鼠同月龄内左室重量比较。

B:四组小鼠四至六月龄间左室重量比较。

该结果表明血压升高过程中左室心肌细胞发生肥大，从而引起多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L)转基因小鼠左心室的重构。

3. 肾组织病理切片HE染色及免疫组化结果显示：多巴胺D5突变基因F173L(D5F173L)转基因小鼠肾小球球囊间隙较正常人D5基因(hD5WT)（对照）转基因小鼠稍微变窄，肾小管上皮细胞内Na-K-ATP酶表达有所增加。

图2.多巴胺D5突变基因DF173L及正常人D5基因(hD5WT)转基因小鼠肾组织HE染色及Na-K-ATP酶免疫组化结果

A: 正常人hD5WT基因转基因小鼠肾组织HE染色。

B: 多巴胺D5突变基因DF173L转基因小鼠肾组织HE染色

C: 免疫组织化学检测Na-K-ATP酶在转正常人hD5WT基因小鼠肾组织中的表达

D: 免疫组织化学检测Na-K-ATP酶在转突变基因多巴胺D5F173L小鼠肾组织中的表达

实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(ILAS-GC-2012-001)。

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。