D5R基因敲除盐敏感性高血压小鼠模型

高血压是由多基因、多环境因素及个人不良习惯相互作用而导致的一种慢性复杂疾病，也是危害人类健康的主要疾病之一。盐是高血压的重要环境因素，个体对盐负荷或限盐呈现不同的血压反应，因此存在盐敏感性问题[1]。盐敏感性是高血压、心脑血管病和其它疾病（如哮喘、胃癌和肾功能不全等）发病及致死的一个潜在危险因素 [2]。因此在高血压临床诊治过程中，考虑盐敏感性将有利于对高血压分类、危险分级以及对症治疗。

盐敏感性通常涉及人口、种族、社会因素以及肾功能、激素水平和饮食习惯等[3]。不同种族和人群盐敏感性个体的检出率不同，而且血压的盐敏感性随年龄增长而变化，特别是高血压患者。盐敏感性由Weinberger[4]给出定义：静脉滴注2L生理盐水，测量平均动脉压（MAP），次日早晨给予低钠饮食后再测量MAP，两次MAP相差≥10mmHg为盐敏感性，否则为盐耐受性。Yatabe [5]定义盐敏感指数（SSI）为低盐和高盐饮食后MAP的差值与低盐饮食MAP的商，若SSI≥5%为盐敏感性。

对于盐敏感性高血压患者，高盐摄入引起血压升高主要有两方面原因：一方面是肾小管对Na+ 重吸收增加，导致水钠潴留，血浆容量增加，从而血压升高；另一方面是内源性哇巴因物质分泌增多，特异性抑制钠泵，胞内钠离子浓度增加，Na+/Ca2+交换体被激活，细胞内Ca2+ 浓度升高，最终导致血管平滑肌或心肌收缩，引起高血压 [6].Drd5是多巴胺受体的五种亚型中最特异的受体之一，一种持久的自激活受体，与人类原发性高血压和心肌病密切相关。有研究表明整体D5R基因敲除导致小鼠高血压和代偿性心脏肥大[7]。我们实验室的研究也表明，Drd5基因敲除能够诱导小鼠血压的升高。

1.C57小鼠，名称：C57，近交系（Inbred Rat）

品系来源 ：1)遗传背景及亚系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57号与雄鼠52号交配，而得C57BL6。亚系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因标记：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遗传学特征：a免疫学特征：一般饲养条件下免疫球蛋白的量随年龄而增加，而到生后20个月时则1gG增长缓慢，无菌饲养的绝对量较低。gM水平较高，出生12月以后，有的个体超过80ug/mL。无菌饲养的动物lgM量比一般饲养的高。细胞免疫低下者少见，这可能与自发肿瘤少有关。b。形态学特征：在新生鼠中，雌鼠为16.8%，雄鼠3%为小眼或无眼症。0.6%后肢可见多趾症，另外水头症占2%4%，耳头症占0.4%，交合不全占3%。c生理学特性：有强嗜酒精性。对放射性照射为中等强度感应度，LD50为630+4R，将雄鼠皮肤移植到同系的雌鼠身上，约20日被排斥掉，这是因为在组织相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常显著。d癌发生率：乳癌发生率低，为01%，白血病为7%-16%化学致癌成功率低，放射性照射较容易诱发肝癌。

2.高血压对照小鼠：C57小鼠，名称：C57，同类系（Consomic Rat）

3.诱导方法：D5-/-小鼠的获得：首先获得构件打靶载体，利用同源重组技术把新霉素抗性基因反向插人到129/sv小鼠胚胎干细胞有D5受体表达的第二细胞内环基因序列中，抑制D5基因的表达，然后把基因打靶后的胚胎于细胞注射到c57BL／6小鼠胚泡，繁殖培育后产生纯合基因D5-/-.本实验应用的D5-/-小鼠第六代3-6个月龄的小鼠，对照（D5+/+）小鼠作为对照。6月龄D5-/-小鼠及其对照D5+/+，分别给予高盐饮食（4%的NaCl）和正常盐饮食（0.4%的NaCl），连续8周，每周测量血压。

1、D5基因敲除及高盐饮食小鼠血压情况

高盐喂养8周后，通过左颈动脉插管法检测小鼠的血压，我们发现，Drd5多巴胺受体5受体敲出小鼠的血压相比于野生型小鼠明显升高。给予高盐饮食之后，多巴胺受体5受体（Drd5）敲出小鼠进一步升高。而野生型小鼠的血压没有明显升高。说明多巴胺受体5 （Drd5）受体敲出小鼠确实能够参与小鼠血压的调节。

2、D5基因敲除小鼠肾脏NA离子转运蛋白的表达情况

为了进一步确定Drd5受体敲除后，小鼠肾脏钠离子转运蛋白表达情况，我们提取了D5+/+小鼠以及D5-/-小鼠肾脏组织的膜蛋白，我们发现与对照组D5+/+小鼠相比，基因敲除组D5-/-小鼠肾脏组织NaPi2、NCC、ENaC、NKA等蛋白的表达显著升高。这说明D5受体缺失之后，肾脏钠离子调控失调，致使大量钠离子聚集，进一步诱发钠水平衡失调以及高血压的发生发展。

3、D5基因敲除小鼠NADPH氧化酶活性情况

为检测D5受体对NADPH氧化酶的影响，我们用第六代的D5-/-和D5+/+小鼠作为研究对象。ROS作为EH病理生理发生的一个因素，在心血管系统、肾脏中，主要是由NADPH氧化酶产生，因此，我们比较分析了D5-/-和D5+/+小鼠肾脏NADPH氧化酶的表达和活性。P47 (分子量47kDa)是肾脏NADPH氧化酶的细胞浆内的一个组成多肽，为此，我们检测P47的含量代表NADPH肾脏组织中的表达，结果显示：D5-/-鼠肾脏P47的表达量约是D5+/+小鼠的2倍。

进一步对NADPH氧化酶的活性测定发现：D5-/-小鼠肾脏NADPH氧化酶的活性明显高于和D5+/+小鼠，同时经DPI处理的标本，几乎检测不到NADPH氧化酶的活性，证明了检测NADPH氧化酶活性方法的特异性。分析结果表明，多巴胺通过D5，受体抑制NADPH氧化酶的表达和活性。

4、D5基因敲除小鼠ROS产生的情况

NOX家族均可诱导ROS的产生，定位于质膜上，可感受细胞外刺激信号，是信号分子的ROS主要来源。因此我们检测了肾脏组织膜蛋白NOX4表达的情况。蛋白印记结果显示，D5-/-小鼠肾脏NOX4的表达显著高于和D5+/+小鼠。肾脏NOX4的高表达也提示D5基因对肾脏ROS表达的调节作用，诱导肾脏组织损伤，进一步加剧高血压的发生发展。

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。