人肺腺癌A549绿色荧光标记细胞BALB／c裸小鼠模型

肺腺癌（lungadenocarcinoma）是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部 X 线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。腺癌是腺上皮恶性肿瘤，可以有腺泡、乳头、细支气管肺泡或实性生长方式。它常伴有黏液产生，检测黏液需要特殊的染色，尤其在检测分化差的肿瘤时。黏液的检测有时能够鉴别实性腺癌与其他形态表现一样的大细胞癌。

腺癌大约占肺原发肿瘤的40%。肺癌在早期并没有什么特殊症状，仅为一般呼吸系统疾病所共有的症状，如咳嗽、痰血、低热、胸痛、气闷等，很容易忽略。

早期肺外表现包括：（1）骨关节症状：此类症状较为多见，由于肺癌细胞可产生某些特殊的内分泌激素（异源性激素）、抗原和酶，这些物质运转作用于骨关节部位，而致骨关节肿胀疼痛，常累及胫、腓、尺、桡等骨及关节，指趾末端往往膨大呈杵状指，x线摄片检查可见骨膜增生。（2）肩背痛：肺外围型肺癌常向后上发展，侵蚀胸膜，累及肋骨和胸壁组织，从而引起肩背痛。这类患者很少有呼吸道症状。（3）声音嘶哑：肺癌转移灶压迫喉神经，可使声带单板机麻痹而致声音嘶哑。由于肺癌的转移灶在早期即可出现，并且转移灶有时可长得比原发灶快，因此转移灶的临床表现可先于原发灶出现。

肺癌晚期症状会因病人体质不一样而有一定的差别，肺癌晚期时病情比较严重，需要及时对症治疗。疼痛是肺癌晚期患者经常表现出来的症状，大多数已发生胸内区域性播散的肺癌患者均有胸痛的症状。声音嘶哑是肺癌晚期症状之一。控制左侧发音功能的喉返神经由颈部下行至胸部，绕过心脏的大血管返行向上至喉，从而支配发音器官的左侧。因此，若肿瘤侵及纵隔左侧，使喉返神经受到压迫，声嘶便产生了，但却无咽痛及上呼吸道感染的其它症状。 面、颈部水肿也是肺癌晚期症状中比较常见的，若肿瘤侵及纵隔右侧压迫上腔静脉，最初会使颈静脉因回流不畅而怒张，最后还会导致面、颈部水肿，这需要得以及时诊断和处理。气促、胸腔积液也是肺癌晚期症状中的表现。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量医学资料表明肺癌的危险因子包含吸烟（包括二手烟）、石绵、氡、砷、电离辐射、卤素烯类、多环性芳香化合物、镍等。具体如下：（1）吸烟：长期吸烟可引致支气管粘膜上皮细胞增生，磷状上皮增生诱发鳞状上皮癌或未分化小细胞癌，无吸烟嗜好者虽然也可患肺癌但腺癌较为常见，纸烟燃烧时释放致癌物质；（2）大气污染：随着产业革命的兴起、现代工业的发展、城市人口的密集、煤炭和石油燃料使用量的迅猛增长，大气污染日趋严重。国内外流行病学研究报告表明，大气污染易诱发肺癌而使死亡率增高；（3）职业因素：长期接触铀、镭等放射性物质及其衍化物、致癌性碳氢化合物、砷、铬、镍、铜、锡、铁、煤焦油、沥青、石油、石棉、芥子气等物质均可诱发肺癌，主要是鳞癌和未分化小细胞癌；（4）肺部慢性疾病：如肺结核、矽肺、尘肺等可与肺癌并存，这些病人种癌肿的发病率高于正常人，此外肺支气管慢性炎症以及肺纤维疤痕病变在愈合过程中可能引起鳞状上皮化增生，在此基础上部分病例可发展成为癌肿；（5）人体内在因素：如家族遗传、免疫机能降低、代谢活动及内分泌功能失调等。

A549细胞系来源于一位58岁肺癌男性患者，由D.J. Giard等人于1972年通过组织原代培养获得。M. Lieber等人的进一步研究表明A549细胞系能够通过胞苷二磷酸胆碱途径借助高不饱和脂肪酸合成卵磷脂，且该细胞免疫酶标染色呈现角蛋白阳性反应。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/c-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/c-nu/+）。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，每窝平均成活3.62只仔鼠，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

1 细胞培养：A549细胞为本实验室冻存

2 构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

3 细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000Reagent转染A549细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的A549-eGFP细胞系（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察，并用Slide Book 4.0软件进行荧光光子数分析。

图1皮下接种A549-GFP肿瘤生长影像分析

图2荧光标记肿瘤生长曲线

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第5周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光光子数成正相关（图1、图2）。

保存状态：冷冻

保存地点：中国医学科学院实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室

该小动物模型饲养在清洁级动物中，微生物处于监控状态，动物房有相应的保护措施，小鼠不会出现逃逸，不会对外界环境造成影响。