慢性不可预测应激诱导大鼠抑郁模型

抑郁症是一种严重影响人体健康的精神疾病，其患病率约占总人口的3% [1]。世界卫生组织预测到2020 年抑郁症将成为第二大主要疾病之一，给社会带来极大经济负担[2]，抑郁症已成为全世界共同面临的卫生健康难题。近年来研究发现，应激性生活事件是抑郁症的显著促发因素[3]，引发抑郁的主要原因是来自慢性、低强度、长期的日常压力。

文献中关于建立该模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性不可预测应激（Chronic unpredictable mild stress, CUMS）动物模型采用常用的模式动物，如大鼠和小鼠。多选用Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[4-9]。关于大小鼠的选择，80%的研究选择了大鼠，雄性多见。目前，文献报道的CUMS刺激因子的多变性、不可预见性是模型成功的关键，单独使用一种刺激不能产生理想的效果，每种刺激因子应间隔3～7 d[10]，大部分CUMS造模过程都选择了7-11种刺激因子，只有少数实验选择了≥12或≤6种的刺激因子，最少的用了4种，最多的用了14种。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最为常见。本模型选用适宜的造模时间-35天，以及常用的几种刺激因子，确定该模型诱导的抑郁模型为现代人类长期处于慢性不可预测应激作用下诱发的抑郁症机理研究、防护和药物研究提供实验模型。

参考文献：

[1] Sartorius N.The economic and social burden of depression.J Clin Psychiatry 2001; 62 Suppl15: 8–11.

[2] Murray CJ,Lopez AD. Alternative projections of mortality and disability by cause1990-2020: Global Burden of Disease Study. Lancet 1997; 349(9064): 1498–1504.

[3] 赵幸福, 徐一峰. 生活事件与抑郁症[J]. 上海精神医学, 1995, 7(3):209–211.

[4] 黄莺, 徐维平, 魏伟,等. 黄精皂苷对慢性轻度不可预见性应激抑郁模型大鼠行为学及血清中微量元素的影响[J]. 安徽医科大学学报, 2012(3):62-65.

[5] 梁军, 陈燕, 胡敏, 等. 慢性不可预知性应激刺激建立大鼠颞下颌关节紊乱病模型[J]. 实验动物科学, 2009, 26(1):15-18.

[6] 姜宁, 范琳犀, 杨玉洁, 等. 金钗石斛提取物对慢性不可预见应激模型小鼠的抗抑郁作用[J]. 生理学报, 2017(2):41-48.

[7] 陈海军, 王慧茹, 胡嘉航, 等. 宁夏无果枸杞芽提取物对慢性温和不可预见性应激小鼠学习、记忆的影响[J]. 神经解剖学杂志, 2014, 30(02):88-93.

[8] 荆然, 李慧峰, 程艳刚, 等. 五味子不同炮制品对小鼠慢性不可预知性应激抑郁的改善作用[J]. 现代药物与临床, 2016, 31(11):1698-1702.

[9] 黄巧玲, 吴华丽, 蔡旻煊, 等. 皮质酮与慢性不可预见性应激诱导的两种抑郁症模型比较[J]. 解剖学报, 2017,048(003):273-281.

[10] Willner P．Chronic mildstress ( CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiologicalconcordance in the effects of CMS[J]. Neuropsychobiology，2005, 52(2) :90-110．

1 动物：SPF级SD大鼠，30只，雄性，体重180-220g。分为空白对照组、CUMS模型组、阳性药组。

2 模型诱导方法：

慢性不可预测性应激模型的建立

在本课题组前期CUMS应激方法的基础上进行改进。除正常对照组外，其余大鼠每日随机接受各种不同的应激源的刺激，包括：束缚 6h、湿笼 12 h、冰水游泳（4°C）5min、热水游泳（42°C）5min，频闪12h、45度斜笼7 h、夹尾3min, 噪音24 h、电击10 min、昼夜颠倒、持续光照36h、禁食禁水24h、冰水游等刺激，每天随机安排，同一种刺激不能连续出现，使动物不能预见给予的刺激，每日1～2种。造模时间持续35d。从造模开始各组分别灌胃给予相应药液，给药期间各组继续造模，连续给药35d，末次给药后进行相关行为学检测，并取脑组织进行相关检测。空白对照组正常饲养。

时间-造模方式-具体安排

星期一

冰水游泳10min+频闪12h+噪音30min

8:50am-9:00am 冰水游泳

9:00-9:30am噪音

9:00am-9:00pm频闪

星期二

禁水12h+湿笼12h

9:00pm-9:00am湿笼

星期三

电击5min+昼夜颠倒

9:00am-9:30am 电击

星期四

热水游泳10min+频闪12h+噪音30min

8:50am-9:00am热水游泳

9:00-9:30am噪音

星期五

禁食12h+间断照明30min

9:30am-9:30pm束缚

9:30pm-9:30am倾笼

星期六

夹尾3min +频闪12h+噪音30min

9:00-9:30am噪音

9:00am-9:00am频闪

星期日

束缚6h+倾笼12h

8:30am-8:30pm禁食；9:00am-9:00pm间断照明

1 实验材料

（1）药品与试剂：

盐酸氟西汀片，批号：20190516，常州四药制药有限公司。标准物质多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）来自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美国莫州）。酶联免疫吸附测定BDNF、CORT试剂盒购自南京建成生物技术研究所（南京，中国）。

（2）仪器：

① 行为学检测：糖水偏爱、新奇环境摄食抑制实验、大鼠悬尾实验、大鼠强迫游泳实验

② 机制检测：全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 评价方法

（1） 行为学评价:

① 糖水偏爱：

分为训练期和测试期。训练期内，实验共需3d，第一个24h，大鼠饮水瓶为两瓶均装有1%蔗糖水各100ml；第二个24h，大鼠饮水瓶为一个瓶装有1%蔗糖水100ml，一个瓶装纯净水100ml；再经过24h的禁食禁水后，进行动物的基础糖水/纯水消耗实验：同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水100ml，一瓶纯水100ml，1h后，取走两瓶并称重，计算动物的总液体消耗，糖水消耗，纯水消耗，糖水偏好指数。为避免位置偏爱影响因素，测试中间，将两瓶位置互换。造模前，进行糖水偏好训练及基线测试，根据测试结果，将动物分组。造模结束后，再进行一次糖水偏爱测试，以评价动物快感缺失的症状。

② 新奇环境摄食抑制实验

采用圆形敞箱（直径90cm，高60cm），每次检测前再测试箱中心放3粒同等大小的食丸。大鼠在禁食禁水24小时后，面向测试箱壁沿着箱壁放入敞箱中，每次从同一方向、同一位置放入，记录15 min内第一次摄食潜伏期（以大鼠第一次咬食食丸为标准），即动物自放入测试箱中至首次摄取食物的时间。（2）皮质酮含量的测定

③ 大鼠悬尾实验

于距大鼠尾尖部用胶布缠上挂于支架上, 使大鼠成倒挂状态, 其头部离箱底约5cm。悬挂时间为6min, 统计大鼠后4min内悬尾累积不动时间（不动状态即大鼠停止挣扎不动或无任何活动）。

④ 大鼠强迫游泳实验

大鼠强迫游泳实验方法分为训练期和测试期，大鼠放入装有30cm水的透明亚克力塑料圆桶内（直径18cm，高40cm）, 水温维持在24 ± 1°C，连续两天游泳。第一天使其预游泳（预适应）15min。24h后进入测试期，将大鼠放入桶中，记录5min内大鼠的不动时间（不动即大鼠停止挣扎，呈漂浮直立状态，仅有偶尔的肢体运动以及保持头部浮在水面的持续时间）。

⑤ 神经递质检测

采用实验室前期的实验方法-LC-MS/MS进行测定。

色谱条件：色谱柱 2.0 mm×150 mm，3 μm（TSK Gel amide 80，TOSOH公司）；流动相：乙腈-15 mM甲酸铵水溶液（pH 5.5）（40:60）；柱温：35 ℃；样品室温：4 ℃；流速：0.4 ml/min。

质谱条件：以电喷雾电离方式进行离子化，以多反应检测（MRM）模式进行扫描，离子源及其他相关参数优化为：TEM: 500 ℃; CAD: Medium; Gas1: 50 psi; Gas2: 70 psi; CUR: 20psi。+MRM模式参数为：喷雾电压5500 V; EP: 10; CXP: 10；-MRM模式参数为：喷雾电压-4500 V; EP: -10; CXP: -13；

本实验采用健康成年SPF级大鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

生活性应激源暴露是临床抑郁症的重要诱发因素。临床研究表明，长期暴露于不可控、不可预见的生活事件的人更容易催患抑郁障碍。CUMS 动物模型让动物经历多种慢性不可预知、低强度刺激，与人类抑郁症诱因相似，其病因和病理机制接近于人类抑郁症，是经典抑郁症动物模型，广泛应用于抗抑郁药物作用的研究。20 世纪80 年代早期，Katz 开始了对慢性应激模型的研究，即给予动物一系列高强度刺激因素(电击、噪声、长时间行为限制等)，连续三周，动物表现出抑郁样状态。Willner在此基础上进行了改进，降低了应激刺激的强度，延长应激时间，并将快感缺乏的测试作为CUMS 的主要评价方法，建立了CUMS 动物模型。该模型主要模拟了人类抑郁的核心症状：快感缺乏，同时也模拟了中重度抑郁症的其他表现，如社会交往能力下降，探索行为能力下降等。

本研究中，通过糖水偏爱你实验、新奇抑制摄食实验、悬尾实验和强迫游泳结果可以看CUMS模型组大鼠糖水偏爱指数下降、新奇摄食抑制实验潜伏期延长、悬尾及强迫游泳实验不动时间延长，与正常组相比，具有显著性差异，而经典的抗抑郁药氟西汀给药可以逆转这些抑郁样行为。提示大鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层和海马组织的5-HT和DA神经递质水平显著性降低，血清皮质酮含量显著升高，海马BDNF水平显著降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠抑郁样行为，并且经过本实验室的验证，该实验条件对于小鼠同样适用。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对大鼠造成慢性不可预测应激模型，通过糖水偏爱、新奇环境摄食抑制实验、悬尾、强迫游泳实验等经典行为学指标，以及神经递质、皮质酮和神经营养因子等基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导大鼠抑郁模型的成功，并且该模型对于BALB/c 小鼠等同样适用，本模型可用于进一步的抗抑郁药物的药效学评价。