慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆障碍模型

Katz[1]等在20世纪80年代早期开始慢性应激模型的研究，连续三周给予动物一系列高强度刺激因素如电击、冰水游泳等，动物呈现抑郁状态。Willner[2]等在此基础上，降低了应激刺激的强度，延长应激时间，并将快感缺失测试作为该模型的主要评价方法，形成了慢性不可预测性温和应激模型（CUMS）。应激因子包括昼夜节律的调整和光照性质的改变( 闪光、间断光照)、食物和饮水的调整、环境的改变( 鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击足底、游泳等。应激因子的多变性和不可预测性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。研究发现，CUMS能够造成小鼠空间学习记忆障碍[3]。

因此，本研究聚焦于CUMS对老鼠学习记忆的影响，采用Morris 水迷宫检测慢性应激对大鼠依赖性空间学习记忆能力的影响；采用避暗行为学检测慢性应激对小鼠记忆的获得、巩固、再现等过程。慢性应激对于Morris 水迷宫的影响，研究报道不尽一致。有研究发现慢性应激可损伤大鼠的空间学习记忆功能[4]。有报道认为，慢性应激可促进动物在Morris 水迷宫测试中的学习记忆功能[5]。本研究采用Morris 水迷宫检测慢性应激对大鼠空间学习记忆能力的影响。避暗实验是利用啮齿类动物趋暗避明的习性设计，动物进入暗室即遭足底电击，反复数次后形成条件反射[6]。这种厌恶性条件反射形成快且恐惧记忆持续时间长，是较为敏感的学习记忆评价方法。本研究利用避暗实验评价CUMS 小鼠模型的认知功能损伤。

目前，文献报道的CUMS刺激因子刺激因子的多变性、不可预见性是模型成功的关键，单独使用一种刺激不能产生理想的效果，每种刺激因子应间隔3～7 d[7]，大部分CUMS造模过程都选择了7-11种刺激因子，只有少数实验选择了≥12或≤6种的刺激因子，最少的用了4种，最多的用了14种。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最为常见。本模型选用适宜的造模时间-35天，以及常用的几种刺激因子，确定该模型诱导的认知障碍模型为现代人类长期处于慢性不可预测应激作用下诱发的学习记忆减退机理研究、防护和药物研究提供实验模型。

参考文献：

[1] KATZ R.Animal model of depression: pharmacological sensitivity of a hedonic deficit[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1982, 16(6): 965-8.

[2] WILLNER P.Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model ofdepression: a 10-year review and evaluation [J]. Psychopharmacology (Berl),1997, 134(4): 319-29.

[3] 瞿礼萍, 曾南, 梁珂, 等. 逍遥散对慢性温和应激模型小鼠行为学及空间学习记忆能力的影响[J]. 中药药理与临床, 2007,23(5):18-21.

[4] CUADRADO-TEJEDOR M, RICOBARAZA A,DEL RIO J, et al. Chronic mild stress in mice promotes cognitive impairment andCDK5-dependent tau hyperphosphorylation [J]. Behav Brain Res, 2011, 220(2): 338-43.

[5] GOUIRAND A M, MATUSZEWICH L. Theeffects of chronic unpredictable stress on male rats in the water maze [J].Physiology & Behavior, 2005, 86(1-2): 21-31.

[6] SHULZ D,CHERNICHOVSKY D, ALLWEIS C. A novel method for quantifying passive-avoidance behaviorbased on the exponential distribution of step-through latencies [J]. PharmacolBiochem Behav, 1986, 25(5): 979-83.

[7] Willner P．Chronic mildstress ( CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiologicalconcordance in the effects of CMS[J]. Neuropsychobiology，2005, 52(2) :90-110．

1 动物：雄性Wistar 大鼠，180-220 g，SPF 级。分为空白对照组、CUMS模型组，每组10只。 雄性 BALB/c 小鼠，26-28 g，SPF 级，分为空白对照组、CUMS模型组，每组12只。

2 模型诱导方法：

（1）大鼠慢性不可预测性应激模型的建立

在本课题组前期CUMS应激方法的基础上进行改进。除正常对照组外，其余大鼠每日随机接受各种不同的应激源的刺激，包括：应激因素包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、强迫游泳（25℃，20 min 或10 ℃，5 min）、噪声3 小时、行为限制（使用自行研发的大鼠行为限制器，长20cm, 直径7 cm），配对饲养、湿笼、倾笼等。应激时间为5 周，每日2-3 种，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，避免动物产生适应性。末次给药后进行相关行为学检测，并取脑组织进行相关检测。模型组单笼饲养，正常组大鼠群养，每笼5 只，并放置另外房间饲养。

（2）小鼠慢性不可预测性应激模型的建立

应激因素包括：禁食、禁水、强迫游泳，配对饲养、湿笼、倾笼、昼夜颠倒等。应激时间为5 周，每日2-3 种，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，避免动物产生适应性。具体刺激时间同大鼠（表1）

1 实验材料

（1）药品与试剂：

标准物质多巴胺（DA）、乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）来自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美国莫州）。 （2）仪器： ① 行为学检测：水迷宫仪器 ② 机制检测：全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 评价方法 （1） 行为学评价: ① 大鼠水迷宫实验 水迷宫实验（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宫计算机图像实时检测分析处理系统进行。大鼠水迷宫为直径180cm，高60cm 圆形的水池。在水池壁上标明4 个点，并据此将水池分为四个象限，于其中一象限中心置一直径为10cm，高30cm 的铁质圆形平台，水面高于平台1cm，水温控制在(25±2)℃。水迷宫测试分为两个阶段，即①定位航行实验，历时5 天，每只动物每天3 个象限（实台象限除外），将大鼠面向池壁放入水中，记录1.5 min 内寻找平台所需时间(寻台潜伏期)。若大鼠入水后1.5 min 内未能找到平台，则将其置于平台上并停留30s，寻台潜伏期记录为1.5 min。② 空间探索实验，定位航行实验结束后撤除平台，将大鼠面向水壁从对角象限入水放入池内，记录1.5 min 内，动物在实台象限的游程、时间等指标。

② 小鼠避暗实验

避暗实验前一天，将动物头部背向电动门自明室放入，任其在明暗室内自由活动以熟悉环境。5 min 后，取出，放回原笼。实验分为记忆获得和巩固两个阶段，均于给药1 小时后开始检测。记忆获得阶段：将动物头部背向电动门自暗室放入，暗室电压幅度为39v。检测时间为5 min。软件自动记录5 min内错误次数、暗室时间及暗室路程。24 小时后，进行记忆巩固实验：将动物头部背向电动门自明室放入，即开始实验，电压幅度为39 v。软件自动记录5 min 内错误次数、入暗潜伏期、暗室时间及暗室路程。

③皮毛状态测试

皮毛状态测试在实验前及应激刺激结束后各测试一次。皮毛状态测试部位包括头、颈、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七个部位。皮毛整洁，计0分，皮毛脏乱，计1分。皮毛状态指数=计分总数/部位数。

2 机制的检测

①CUMS对大鼠神经递质检测

采用实验室前期的实验方法-LC-MS/MS进行测定。

色谱条件：色谱柱为 TSK-GEL Amide-80，柱温35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）为流动相，0.2 mL/min 流速。

质谱条件：ESI 离子源；正离子模式检测；电喷雾电压为4500V；信号采集方式为多反应检测（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

标准溶液的配制：精密称取标准品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的储备液（-80℃保存），临用前分别吸取各神经递质的标准储备液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合标准液，涡旋混匀，然后分别稀释至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合标准液，稀释后每200 μL混合标准液中加入300 μg/ml 的内标溶液20 μL。标准溶液均在临用前配制。

测定方法：组织称重，向EP 管中加入200 μl 纯水。用超声破碎仪进行匀浆，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱内过夜。次日从冰箱内取出样品，在4℃离心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加内标20μL(300μg/mL DHBA)，将样品50μl 注入LC-MS/MS 进行分析。

②CUMS对小鼠神经递质检测

方法同大鼠。

统计分析

实验结果采用SPSS 22. 0 统计软件进行统计学分析，结果以均值±标准误（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 进行组内比较，使用最小显著差数法（LSD）多重比较方法比较两组间差异，当P <0.05则认为差异具有统计学意义。

3. 结果

（1）CUMS对大鼠的影响

① CUMS对大鼠体重的影响

CUMS 模型组大鼠在应激发生第2、3、4、5 周后体重较正常组明显下降（P<0.01）。西酞普兰组未能逆转应激因素导致的体重下降。

② CUMS对大鼠水迷宫的影响

前5天的定位航行中，CUMS大鼠从第二天起寻台潜伏期比正常大鼠长（P<0.05）。在第六天的空间探索实验中CUMS大鼠与正常大鼠相比，跨平台位置次数明显减少（P<0.05）。

（2）CUMS对小鼠的影响

①CUMS对小鼠体重的影响

随着应激时间的延长，CUMS模型组体重增加缓慢，第5周时，模型组体重明显下降，与正常组相比，具有显著性差异。

③ CUMS对小鼠避暗实验的影响

结果显示，避暗实验记忆巩固阶段，CUMS模型小鼠入暗次数及在暗室中的时间和路程均明显增加，与正常组相比，具有显著性差异（P<0.01）。图3 CUMS模型对小鼠避暗实验的影响（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，与正常组比较） （3）机制检测结果 ① CUMS对大鼠前额皮层组织神经递质的影响

CUMS 模型组前额皮层5-HT含量较正常组明显下降（P<0.01），模型组前额皮层NE含量较正常组明显下降（P<0.05）

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。