核苷酸寡聚结合域蛋白(NOD2)基因敲除免疫性疾病小鼠模型

该基因是Nod1/Apaf-1家族的成员，编码一个含有两个caspase(CAD)结构域和6个富含亮氨酸重复序列(LRRS)的蛋白质。该蛋白主要在外周血白细胞中表达。它在细胞内细菌脂多糖(LPS)的免疫应答中起着重要的作用，它通过识别细胞内细菌脂多糖(LPS)衍生的MDP，激活细胞内的NFKB蛋白，从而参与细胞内脂多糖的免疫应答。该基因突变与克罗恩病和Blau综合征有关。另外，还发现了编码不同异构体的剪接转录体。为了研究免疫相关疾病，所以我们应用CRISPR/Cas9技术制作了NOD2全身敲除小鼠。

实验材料：

1 实验动物： SPF级C57BL/6J小鼠品系，购买并饲养于中山大学东校区实验动物中心，动物生产合格证号：SCXK（粤）2016-0029；实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2016-0112，动物房温度（20～26）℃，相对湿度40%～70%。

2 质粒及其他： pX330质粒：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9vector质粒（Addgene plasmid # 42230），为张峰实验室赠送。 Cas9 mRNA购于Biomics Biotechnologies，China。

3 试剂： 实验过程中用到的酶（如BbsI，T4 PNK，快速连接酶等）以及PCR扩增相关试剂均购于NEB公司；体外转录所用的MEGAshortscript T7（AM1354）试剂盒购于Thermofisher Scientific公司；其他试剂如无特殊说明均购于Qiagen公司。

4仪器：该模型制备过程中使用到了如下仪器：显微注射系统（Eppendorf）,凝胶电泳系统(Bio-Rad)，凝胶成像仪（Bio-Rad），酶标仪（Bio-Rad），PCR仪（Bio-Rad）

实验规程：

1 sgRNA的制备

将合成的正向引物和反向引物经磷酸化退火后，形成DNA双链。DNA双链经快速连接酶连接到BbsI酶切后的pX330载体上，随后转化至DH5a大肠杆菌，涂布于含有氨苄抗生素的LB培养板。将测序后成功连接有sgRNA的克隆质粒，使用含有T7启动子的引物进行PCR扩增，将扩增后的产物使用PCR的纯化试剂盒纯化后，使用MEGAshortscript T7试剂盒进行体外转录，最后使用酚/氯仿抽提和无水乙醇沉淀得到sgRNA，并用Nuclease Free水进行重悬。通过琼脂糖凝胶电泳检测质量及条带大小是否正确后测浓度，分装储存于-80℃。

2 小鼠受精卵显微注射

将体外转录所得的sgRNA1、sgRNA2与Cas9mRNA，用Nuclease Free水稀释，使其浓度分别为50ng/ul、50ng/ul、100ng/ul。使用显微注射仪将其注射到C57BL/6J小鼠0.5天的胚胎中，显微注射后的胚胎在37℃，5% CO2培养24h后，进入二细胞，然后移植到假孕的CD1母鼠体内，正常饲养。

（造模机制）

在胚胎时期，利用Crispr/Cas9技术来靶向大片段敲除NOD2基因。

（造模方法）

1、筛选制作NOD2敲除模型的sgRNA位点，本模型的制作使用了两个sgRNA位点，已达到敲除两个位点之间的片段序列的目的。

2、用显微注射方法把载体注射到准备好的受精卵之内。

在得到F1代小鼠时，进行鼠尾基因测序及WB检测，（见图三）。

动物实验设施已获得由广东省科技厅颁发的实验动物生产许可证和实验动物使用许可证,编号为SYXK(粤）2016-0112，符合国家相关法律规定。

利用crispr/cas9方法建立NOD2-KO小鼠，可以保证NOD2缺失的稳定遗传。因此，NOD2相关免疫疾病可以利用此种KO小鼠进行实验。