二氢蝶酰谷氨酸还原酶检测

引言

二氢蝶酰谷氨酸还原酶（Dihydrofolate Reductase, DHFGR）是叶酸代谢途径中的关键酶之一，负责催化二氢叶酸（DHF）还原为四氢叶酸（THF）。THF作为一碳单位转移反应的核心载体，直接参与DNA合成、氨基酸代谢及甲基化反应等生物过程。DHFGR活性异常可能导致巨幼细胞性贫血、免疫功能紊乱及某些遗传性疾病。因此，准确检测DHFGR的活性或表达水平，在临床诊断、药物研发和基础研究中具有重要价值。本文将系统介绍DHFGR检测的范围、项目、方法及仪器，以期为相关领域提供参考。

检测范围

DHFGR检测主要应用于以下场景：

• 遗传性疾病筛查：如先天性叶酸代谢缺陷症；
• 肿瘤与免疫疾病研究：评估化疗药物（如甲氨蝶呤）的靶向作用效果；
• 临床诊断：巨幼细胞性贫血的病因鉴别；
• 药物开发：针对DHFGR抑制剂的药效学评价。

检测项目

DHFGR检测的核心项目包括：

• 酶活性测定：单位时间内底物转化量或产物生成量；
• 基因突变分析：筛查DHFR基因的致病性变异；
• 代谢物水平检测：血浆或细胞内THF/DHF比值；
• 辅助指标：血常规中红细胞平均体积（MCV）、血清同型半胱氨酸浓度等。

检测方法

1. 分光光度法

通过监测NADPH在340 nm处的吸光度变化，间接反映DHFGR活性。反应体系中加入DHF和NADPH，酶促反应导致NADPH氧化，吸光度下降速率与酶活性正相关。该方法灵敏度高（检测限可达0.1 U/mg蛋白），但易受样本中杂酶干扰。

2. 液相色谱法（HPLC）

直接定量THF生成量：将反应产物经色谱柱分离后，通过紫外检测器（检测波长294 nm）或荧光检测器（激发波长305 nm，发射波长365 nm）分析。HPLC特异性强，可同时检测多组分，适用于复杂生物样本。

3. 分子生物学方法

采用PCR扩增DHFR基因外显子区域，结合Sanger测序或二代测序（NGS）技术识别突变位点。对于拷贝数变异，可使用多重连接探针扩增（MLPA）技术。

4. 免疫学检测

基于单克隆抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA），定量血清或细胞裂解液中的DHFGR蛋白浓度。常用夹心法，灵敏度为0.5 ng/mL，适用于表达水平较低的样本。

检测仪器与设备

• 分光光度计：需配备温控比色皿（推荐37℃恒温），带宽≤2 nm；
• 液相色谱系统：建议选用C18反相柱（粒径5 μm，内径4.6 mm），流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇梯度；
• 实时荧光定量PCR仪：需配置SYBR Green或TaqMan探针通道；
• 全自动酶标仪：支持450 nm和630 nm双波长校正；

注：样本处理需使用低温离心机（4℃, 10,000×g）、精密移液器（误差<1%）及无RNase/DNase耗材。

质量控制与注意事项

• 活性检测时需加入阳性对照（重组DHFGR）和空白对照（热灭活样本）；
• 避免反复冻融样本，酶活性在-80℃保存下可稳定3个月；
• 基因检测需遵循ACMG变异解读指南，区分致病突变与多态性位点。

结论

DHFGR检测是揭示叶酸代谢障碍及评估相关疾病诊疗效果的重要工具。临床实践中需根据检测目的（如功能性评价或遗传诊断）选择合适方法，并严格规范操作流程。未来随着微流控芯片和质谱联用技术的发展，检测通量与精准度有望进一步提升。

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