slc25a26基因敲除心肌肥厚小鼠模型

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和( 或) 右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例和散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。 临床表现：1. 以青壮年多见、常有家族史。 2. 可以无症状，也可以有心悸、劳力性呼吸困难、心前区闷痛、易疲劳、晕厥甚至猝死，晚期出现左心衰的表现。 3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左缘可出现粗糙的收缩中晚期喷射性杂音，可伴震颤，应用洋地黄制剂、硝酸甘油、静点异丙肾上腺素及Valsalva动作后杂音增强，反之应用β受体阻滞剂、去甲肾上腺素、下蹲时杂音减弱。有些病人闻及S3及S4心音及心尖区相对性二尖瓣关闭不全的收缩期杂音。临床诊断：超声心动图提示左心室壁或（和）室间隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血压病、风湿性心脏病二尖瓣病、先天性心脏病（房间隔、室间隔缺损）及代谢性疾病伴发心肌肥厚。二、模型背景1、SLC25a26基因信息SLC25a26，该基因属于线粒体载体家族，是定位于线粒体内膜上的核编码转运蛋白。该家族成员运输重要的小分子穿过线粒体内膜。该蛋白参与s -腺苷蛋氨酸(SAM)进入线粒体的运输。该基因的突变与联合氧化磷酸化缺陷有关。• 敲除基因名称（ NCBI 号）： SLC25a26（67582）• 基因 NCBI 网址链接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 67582• 敲除基因名称： SLC25a26• 方案针对的转录本（ Ensembl 号）：ENSMUST00000061118.102、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 腺苷蛋氨酸(SAM)是主要的甲基供体，有一个大光谱的目标底物。因此，它对几乎所有的生物甲基化反应都是必不可少的。SAM是由胞浆中蛋氨酸和ATP的蛋氨酸腺苷转移酶合成的，随后分布在不同的细胞间隔中，包括线粒体，其中甲基化主要用于核酸修饰和呼吸链功能。临床发现包括由呼吸功能不全和水肿引起的新生儿死亡、儿童急性发作心肺衰竭和缓慢进行性肌无力。研究发现SLC25A26突变会导致各种线粒体缺陷，包括那些影响RNA稳定性、蛋白质修饰、线粒体翻译以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。 SLC25A26是s -腺苷蛋氨酸载体(S-adenosylmethionine carrier, SAMC)的编码基因，是线粒体载体家族的一员，是一组存在于线粒体内膜的转运蛋白[1, 2]。SAMC的生理作用是催化SAM(通用的甲基供体)从细胞质摄取到线粒体，在那里它是DNA、RNA和蛋白质的甲基化所必需的，也是硫辛酸和泛醌生物合成的中间体[3]。SAM是通过蛋氨酸循环途径在胞浆中产生的，在蛋氨酸腺苷转运酶的催化下，腺苷从ATP转移到蛋氨酸。SAM进入线粒体的运输严格依赖于其合成，已知合成受到细胞质代谢和线粒体代谢的调控[4]。线粒体代谢通过ATP和叶酸的合成来调节SAM的产生，叶酸循环反应在细胞质和线粒体中被复制。此外，甲硫[5]于由同型半胱氨酸产生的胱氨酸b合酶(cystathionine b synthase, CBS)被SAM变构激活，半胱氨酸产生的谷胱甘肽与胞质SAM的浓度密切相关，而胞质SAM的浓度取决于胞质中产生的量并转入线粒体[6]。同样，SAM对线粒体的可用性可能强烈地改变线粒体甲基化靶点的功能。线粒体DNA (mtDNA)就是这些靶点之一。已知甲基化修饰mtDNA[7]，导致正常和病理条件下mtDNA编码基因表达改变[8-10]。 在不同的正常或病理条件下，SAM对线粒体的可用性可以改变其线粒体靶点如mtDNA的功能。事实上，一些研究已经强调了在正常和病理条件下mtDNA甲基化变化如何改变mtDNA编码基因的表达[8-11]。此外，其他甲基循环成分(如叶酸)的可用性也会影响甲基化过程，叶酸水平通过某些肿瘤抑制基因中CpG岛的高甲基化与发生宫颈癌的风险成反比[12]。此外，SLC25A26突变导致SAMC功能受损，显著影响不同的线粒体过程，如RNA稳定性、线粒体翻译和ATP合成[13]。基于这一证据，SLC25A26基因的表达和SAMC的活性有望通过协调几个代谢事件对细胞功能产生强烈的影响。然而， SLC25A26在肺结核及心血管疾病中是否发挥功能，以及作用机制是什么还有待我们进一步的探究。参考文献：1. Palmieri, F., The mitochondrial transporter family SLC25: Identification, properties and physiopathology. Molecular Aspects Of Medicine, 2013. 34(2-3): p. 465-484.2. Palmieri, F., Mitochondrial transporters of the SLC25 family and associated diseases: a review. Journal Of Inherited Metabolic Disease, 2014. 37(4): p. 565-575.3. Agrimi, G., et al., Identification of the human mitochondrial S-adenosylmethionine transporter: bacterial expression, reconstitution, functional characterization and tissue distribution. Biochemical Journal, 2004. 379: p. 183-190.4. Wallace, D.C. and W.W. Fan, Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion, 2010. 10(1): p. 12-31.5. Lacobazzi, V., et al., Hyperhomocysteinemia: Related genetic diseases and congenital defects, abnormal DNA methylation and newborn screening issues. Molecular Genetics And Metabolism, 2014. 113(1-2): p. 27-33.6. Prudova, A., et al., S-adenosylmethionine stabilizes cystathionine beta-synthase and modulates redox capacity. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6489-6494.7. Mishra, M. and R.A. Kowluru, Epigenetic Modification of Mitochondrial DNA in the Development of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015. 56(9): p. 5133-5142.8. Castegna, A., V. Iacobazzi, and V. Infantino, The mitochondrial side of epigenetics. Physiological Genomics, 2015. 47(8): p. 299-307.9. Iacobazzi, V., et al., Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool. Molecular Genetics And Metabolism, 2013. 110(1-2): p. 25-34.10. Infantino, V., et al., Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab, 2011. 102(3): p. 378-82.11. Bellizzi, D., et al., The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Research, 2013. 20(6): p. 537-547.12. Butterworth, C.E., et al., Folate-Deficiency And Cervical Dysplasia. Jama-Journal Of the American Medical Association, 1992. 267(4): p. 528-533.13. Kishita, Y., et al., Intra-mitochondrial Methylation Deficiency Due to Mutations in SLC25A26. American Journal Of Human Genetics, 2015. 97(5): p. 761-768.

1．项目策略概述

利用 CRISPR/Cas9 技术，设计并体外转录 gRNA，将 Cas9、 gRNA 同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引导下结合到靶位点进而造成 DNA 双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。

2. Western bloting

用RIPA裂解液从冷冻小鼠心脏组织中提取蛋白质，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE对每个样品中等量的蛋白质（20µg）进行分离，然后转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭这些膜1小时后，将这些膜与以下相对应的一抗在4℃下孵育过夜：SLC25a26（1:1000）、和GAPDH（1:2000）。然后，在室温下与一抗相应的辣根过氧化物酶结合二抗孵育2h。后使用化学发光显影液在化学发光成像系统上曝光显示目标条带，并将目标条带用imageJ (National Institutes of Health)进行量化分析。以每个样本中的GAPDH蛋白含量作为内参进行标准化，得到每个样本中目的蛋白的相对表达水平。

3. 荧光定量PCR

心肌肥厚分子标志物检测。使用TRIzol从将各实验组小鼠心脏组织中提取总RNA，合成cDNA，然后采用SYBR Green PCR MasterMix进行荧光定量PCR。将内源性GAPDH的mRNA含量设为对照检测心肌肥厚指标Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

1、SLC25a26蛋白在TAC手术模型中表达上调

由图1的WB结果可以看出，在TAC手术的模型中，术后4周SLC25a26的蛋白表达量显著上调，且两次实验具有比较一致的结果，该实验证明SLC25a26在心肌肥厚的过程中可能发挥重要作用。

图1 SLC25a26蛋白在TAC手术模型中表达上调。

2、SLC25a26可以抑制心肌肥厚

为了进一步探究SLC25a26在心肌肥厚发生中的具体功能，我们通过siRNA对心肌细胞中的SLC25a26进行了敲低，图2A敲低水平的检测，证明siSLC25a26能够显著敲低SLC25a26的表达；敲低SLC25a26后，心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp及Myh7在心肌细胞中的mRNA的相对表达水平明显上调表达（图2B、2C、2E），而Myh6却明显受到了抑制（图2D），说明SLC25a26在体外确实可以抑制肥厚。

图2 敲低SLC25a26可以加重心肌肥厚。（A）SLC25a26的敲低水平验证；（B-E）敲低Nap1l5后，心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh6和Myh7在心肌细胞中的mRNA的相对表达水平；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vsControl组；P< 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs siNeg组。

鉴定结果示意图：

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

SLC25a26敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。条件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO），是可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。相较于CKO，KO小鼠采集任意组织器官的cDNA，PCR扩增，即可鉴定是否目的基因敲除成功。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

SLC25a26，该基因属于线粒体载体家族，是定位于线粒体内膜上的核编码转运蛋白。临床发现包括由呼吸功能不全和水肿引起的新生儿死亡、儿童急性发作心肺衰竭和缓慢进行性肌无力。研究发现SLC25A26突变会导致各种线粒体缺陷，包括那些影响RNA稳定性、蛋白质修饰、线粒体翻译以及CoQ10和硫辛酸的生物合成的缺陷。而对于该基因在人类衰老阶段是否会在肺结核、心血管疾病中发挥功能却鲜有研究，该研究为Nap1l5的研究提供了新的方向与思路。