实时荧光定量PCR测试

信息概要

实时荧光定量PCR测试是一种基于聚合酶链式反应的技术，通过荧光信号实时监测DNA或RNA的扩增过程，用于准确定量目标核酸序列。该测试在医学诊断、基因表达研究、病原体检测等领域具有重要作用，能够提供高灵敏度、高特异性的结果，确保检测的准确性和可靠性，是现代分子生物学和临床检测中的关键工具。

检测项目

• Ct值
• 扩增效率
• 特异性
• 灵敏度
• 线性范围
• 重复性
• 再现性
• 阴性对照
• 阳性对照
• 熔解曲线分析
• 荧光阈值
• 基线校正
• 扩增曲线
• 标准曲线斜率
• R²值
• 检测限
• 定量限
• 内参基因
• 样本浓度
• 样本纯度
• 样本完整性
• 交叉污染检查
• 仪器校准
• 试剂验证
• 环境监测
• 质量控制参数
• 荧光染料类型
• 循环条件
• 退火温度
• 延伸时间
• 预扩增步骤
• 后扩增分析
• 反应体积优化
• 引物二聚体检查
• 荧光背景校正

检测范围

• 病毒检测
• 细菌检测
• 基因表达分析
• 突变检测
• 转基因检测
• 环境样本检测
• 食品样本检测
• 临床样本检测
• 法医样本检测
• 动物样本检测
• 植物样本检测
• 微生物样本检测
• 细胞样本检测
• 组织样本检测
• 血液样本检测
• 唾液样本检测
• 尿液样本检测
• 土壤样本检测
• 水样本检测
• 空气样本检测
• 食品病原体检测
• 药物残留检测
• 基因分型
• SNP检测
• 拷贝数变异检测
• 甲基化分析
• RNA病毒检测
• DNA病毒检测
• 细菌毒素检测
• 真菌检测
• 寄生虫检测
• 兽医诊断
• 农业应用
• 环境监测
• 科研应用

检测方法

• 标准曲线法：使用已知浓度的标准品建立定量曲线，用于绝对定量分析。
• 比较Ct法：通过比较目标基因和内参基因的Ct值，实现相对定量。
• 绝对定量法：直接计算目标核酸的拷贝数，基于标准曲线。
• 相对定量法：评估基因表达水平相对于对照样本的变化。
• SYBR Green法：使用SYBR Green染料非特异性结合双链DNA，监测扩增。
• TaqMan探针法：利用荧光标记的探针特异性杂交目标序列，提高特异性。
• 分子信标法：使用发夹结构的探针，在杂交时产生荧光信号。
• 杂交探针法：通过两个相邻探针进行荧光共振能量转移检测。
• 多重qPCR：在同一反应中同时检测多个目标核酸。
• 数字qPCR：将样本分割成多个分区，进行绝对定量分析。
• 实时逆转录qPCR：先将RNA逆转录成cDNA，再进行qPCR检测。
• 熔解曲线分析：通过温度梯度检测扩增产物的特异性和纯度。
• 梯度PCR：优化退火温度以提高扩增效率。
• 引物设计验证：确保引物的特异性、效率和避免二聚体形成。
• 探针验证：测试探针的灵敏度、特异性和稳定性。
• 样本预处理方法：包括DNA或RNA的提取、纯化和浓度测定。
• 质量控制方法：设置各种对照和监控参数以确保结果可靠性。
• 仪器校准方法：定期校准qPCR仪器，保证荧光检测准确性。
• 数据分析软件使用：应用专用软件分析Ct值和扩增曲线。
• 优化反应条件：调整如Mg2+浓度、引物浓度等参数。
• 防止污染措施：使用UNG酶等方法避免交叉污染。
• 实时监测设置：配置荧光采集点和循环参数。

检测仪器

• Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
• Roche LightCycler 480
• Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System
• Qiagen Rotor-Gene Q
• Thermo Fisher QuantStudio 5
• Agilent Mx3000P QPCR System
• Eppendorf Mastercycler ep realplex
• Takara TP800 Thermal Cycler
• Bioneer Exicycler 96
• Analytik Jena qTower3
• Bioer LineGene 9600
• Esco Swift Spectrum
• Major Science QCycler
• LongGene ABI StepOnePlus
• Bio-Rad MiniOpticon

问：实时荧光定量PCR测试的基本原理是什么？答：它通过荧光信号实时监测PCR扩增过程，荧光强度与目标核酸量成正比，从而实现准确定量。问：实时荧光定量PCR在疾病诊断中有哪些应用？答：常用于检测病原体如病毒和细菌，以及基因突变，适用于早期诊断、治疗监测和流行病学调查。问：如何确保实时荧光定量PCR测试的准确性？答：通过设置阳性对照、阴性对照，优化反应条件，进行仪器校准和质量控制，确保结果可靠。