胶质瘤活体成像小鼠模型

一、疾病概述

胶质瘤是指由胶质细胞发生癌变，恶性增殖而形成的肿瘤，是最为常见的原发性颅内肿瘤。包括多形性胶质母细胞瘤（GBM, Glioblastomas multiforme）、间变性星形细胞瘤（AA, Anaplastic astrocytomas）、间变性少支星形细胞瘤（AOA, Anaplastic oligoastrocytomas）间变性少支胶质细胞瘤（AO, Ananplastic oligodendrogliomas）等1。其中多形性胶质母细胞瘤（GBM）发病率最高，占所有胶质瘤的一半以上，年发病率约为3.19/10万2。虽然有很多治疗手段，如常用的治疗方案为手术，加术后放疗及替莫唑胺（TMZ）同步化疗，然后为6个疗程的TMZ单独辅助化疗。但疗效并不尽如人意，总的生存期（OS）仅为12-18个月3。严峻的现实急需对其病理病程进行深入研究，探寻新的潜在治疗靶位点，以优化治疗方案，提高患者生活质量及生存时间。

二、研究背景

1、 GL-261胶质细胞瘤信息

GL-261为鼠源胶质瘤细胞系。是常用的用于胶质瘤研究的肿瘤细胞系，体外培养方便，增值快。体内原位注射到小鼠脑后生长迅速，能很好再现临床胶质瘤血管增生等特征。

2、实验动物背景信息

C57BL/6是常用近交系小鼠品系，因其群体基因高度纯合和稳定，繁殖能力强，寿命长等因素广泛应用于肿瘤学和其它多项研究领域。

3、研究背景

虽然科学家建立了很多胶质瘤动物模型，如GL-261小鼠皮下肿瘤模型4，GL-261脑原位小鼠模型等5。但这些模型不能在单细胞水平动态跟踪观察胶质瘤细胞在颅内的生长状况，及与基质细胞和血管的相互作用关系。虽然，也有科学家借助双光子显微镜构建了小鼠活体成像模型，但其实验中用到的为免疫缺陷小鼠6，不能很好再现临床上免疫功能健全的患者胶质瘤生长与免疫细胞的相互作用关系。而应用鼠源的GL-261细胞系及免疫功能健全的C57BL/6小鼠恰能解决这个问题。

图1.小鼠胶质瘤活体成像模型构建。A. GL261-Tdtomato细胞系。B. 小鼠颅窗的制作。C. 肿瘤细胞脑原位接种。D.小鼠脑双光子活体成像。

模型制作方法如上图1所示：

首先，将Ubi-MCS-SV40-Neomycin (Genechem Co.,Ltd, Catalog No. CV084)慢病毒载体转染到GL261-WT肿瘤细胞系内，以构建可以表达红色荧光的GL261-Tdtomato细胞系。

其次，将小鼠脑部毛发去除，剪掉皮肤，暴露颅骨后通过牙科钻头钻一个直径约5.0-5.5 mm的孔洞，并将其移除。暴露脑后需要移除硬脑膜，并粘上直径为6.0 mm的透明玻璃片。

第三，上述手术三到四周后将颅窗移除，将1 µl包含5×104个GL261-Tdtomato细胞的肿瘤细胞悬液原位注射到一侧大脑半球，并重新粘上玻璃片，做好颅窗。

第四，约一周后通过双光子显微镜成像技术动态跟踪观察。

图2.小鼠胶质瘤活体成像。红色：GL261-Tdtomato，绿色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 µm。

如上图2所示，接种肿瘤后第七天，实体胶质瘤已经在颅内形成，且呈弥散性生长。白色箭头显示的是单个肿瘤细胞，绿色箭头指FITC-Dextran透过血脑屏障外渗。这说明随着肿瘤生长，血脑屏障收到破坏。接下来，第10天、第13天，胶质瘤细胞增长迅速，直径已经超过1 mm。并且血管成像显著的病理性改变。

图3.小鼠胶质瘤恶性增殖并伴随血管增生。红色：GL261-Tdtomato，绿色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 µm。

如上图3所示，红色为恶性增殖的胶质瘤细胞，绿色为不同时间节点血管成像情况。在第10天、13天部分肿瘤区域未检测到红色荧光信号，我们推测可能是肿瘤增长过快，导致部分区域缺血、缺氧出现坏死所致。而从第7天到第13天能明显看到血管的增生及病理性改变，这与临床胶质瘤患者是一致的。

为了进一步量化肿瘤生长及血管的增生情况，我们将获取的三位立体图像通过Imaris软件进行了重构和计算。结果如图4所示，胶质瘤和血管的体积和表面积随着时间变化有着显著的增长过程。

图4.小鼠胶质瘤及血管的体积和表面积统计图。

虽然双光子活体成像可以动态跟踪观察单细胞水平肿瘤在颅内的生长情况，但是其观测深度只能到达皮层下500-700 µm。为了更全面的展现胶质瘤在颅内的生长情况，我们在后期也通过核磁（Magnetic Resonance Imaging， MRI）对小鼠的胶质瘤生长情况进行了跟踪观察。如下图5所示，胶质瘤在颅窗下生长迅速。第二十天已经跨两侧脑半球进行生长。在第20天和26天胶质瘤分为几部分生长，而到了第32天这几部分已经张到一起。直径也达到5 mm左右。在获取了MRI影像学数据后我们也同样通过Imaris对其进行了三位立体构建，并计算了其变化情况。结果显示其增长迅速。

图5.小鼠胶质瘤MRI成像及分析。

C57BL/6购自北京唯尚立德生物科技有限公司小鼠饲养于SPF级环境中，机体内无特定的病原微生物和寄生虫存在。肿瘤细胞体外培养和冻存都严格按照实验流程操作。细胞和小鼠均没有向自然环境外溢，无环境和生态威胁。

小鼠颅窗的制作和双光子显微镜活体成像为本模型构建的难点，对个人技术要求较高，需要长期练习并且具有麻醉、解剖、生理等跨学科知识储备。

本模型为同源小鼠胶质瘤模型，较异源模型更能模拟临床上肿瘤病人血管增生，肿瘤弥散性侵袭生长，尤其是探究胶质瘤细胞在恶性增殖过程中与免疫细胞的相互作用关系。如结合免疫细胞表达特异荧光的转基因小鼠即可探究特定免疫细胞对胶质瘤恶性增殖的影响。同时其它基质细胞，如周细胞等亦可借助此模型进行研究。