Stat5 敲除肠干细胞缺失小鼠模型

1. STAT基因（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

STAT(信号转换器和转录激活因子)转录因子家族由STAT 1、3、4和5几种蛋白质组成。Janus激酶(JAK)/STAT信号通路与多种癌症如卵巢癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和结肠癌相关。配体结合启动激活级联反应，最终导致STAT蛋白的磷酸化。磷酸化使STATs从细胞质转移到细胞核并具有转录活性。STAT蛋白的关键激活因子是干扰素、白细胞介素等细胞因子，以及转化生长因子(TGF) b等生长因子或癌基因等。

Stat5是信号转导和转录活化蛋白家族的重要成员，参与了Jak/Stat信号通路调控。Stat5能够影响细胞的增值/分化、存活与凋亡，并且在乳腺癌发育、免疫应答干细胞自我更新调控、造血作用以及肿瘤的发生发展中具有重要作用。

2. 研究背景

在哺乳动物体内，小肠组织是自我更新速度最快的组织之一。整个小肠黏膜大概每3~5d更新一次，主要依赖于小肠干细胞的增殖与分化。研究证实Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等为小肠干细胞的标志基因。在这些标记基因中，Lgr5被认为是最重要的。从功能上分析，Lgr5编码G蛋白偶联受体，在Wnt信号通路中起着重要的作用。从数量上看，Lgr5+干细胞增殖活跃，具有自我更新的潜能，在所有隐窝的底部均大量存在，以维持小肠上皮的稳态。细胞因子- stat5信号通路调控可以调控肠上皮的稳态和损伤反应。我们通过特异性敲除肠道上皮细胞中的STAT5转录因子将STAT5信号通路与IESC的增殖分化联系起来。

实验动物：Stat5 flox小鼠，Villin-CreERT2小鼠

试剂：tamoxifen(50mg/kg)，4%PFA

仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞项目合作单位

实验操作规程：将Stat5 flox小鼠与Villin-CreERT2小鼠杂交，在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。STAT5基因PCR引物序列如下1. GAA AGC ATG AAA GGG TTG GAG 2.AGC AGC AAC CAG AGG ACT AC 3.AAG TTA TCT CGA GTT AGT CAG G,Villin-CreERT2基因PCR引物序列如下:1 GTG TGG GAC AGA CAA ACC 2.ACATCT TCA GGT TCT GCG GG。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。按每只小鼠连续5天按50mg/ kg腹腔注射他莫西芬。诱导后CO2麻醉处死小鼠，取肠道组织，用冷PBS冲洗肠道组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜，1×PBS溶液里浸泡5min。制作冰冻切片及石蜡切片，免疫组化及免疫荧光染色观察肠道干细胞的变化。

1、基因鉴定信息

2 、免疫荧光染色

敲除肠上皮STAT5基因导致肠道干细胞减少

Western结果显示STAT5基因敲除导致肠道干细胞减少

通过FACS分析敲除STAT5基因后干细胞数目明显减少，细胞增殖减少，模型建立成功。

本模型不涉及除遗传物质重组对环境生态影响以外的其它安全性问题，本模型小鼠的保存、使用和处理均按照研究所伦理和安全委员会的要求执行，可以确保不产生安全性问题。